Fecundación ‘in vitro’: una técnica de futuro

Embriovet ofrece una serie de servicios en ganado vacuno, además de incursiones que se hacen en otras especies, como es el caso del ovino de la mano de Ovigén, o como ocurre en equino. El ganadero debe tener una motivación para invertir en transferencia de embriones, que pasa por el desarrollo de un servicio de asesoramiento en genética. Se trata de realizar un programa integral, en el que se cuantifique técnica y económicamente el diseño de los proyectos. Es un esquema que se está siguiendo en el vacuno de leche, pero que puede extenderse al vacuno de carne o a ovino.

El primer paso es analizar la población de un rebaño y ordenarlo de más a menos deseable. Para ello, se necesita su criterio de selección. En el caso de Holstein en vacuno, se tiene mucha información y se pueden escoger índices que ofrecen una lectura de la rentabilidad de los animales. Pero se puede hacer por producción de leche, una combinación de producción y calidad, alguna combinación de características morfológicas, longevidad, fertilidad…

Al ordenar las ovejas de más a menos deseable, se obtiene una distribución en forma de campana de Gauss, por lo que la mayoría están alrededor de la media. De esta forma, se puede seleccionar únicamente de los mejores animales. Si se tienen herramientas como el semen sexado, se puede dar un paso más en la intensidad de la selección, ya que se necesitan menos ovejas para hacer la recría. Un paso más sería utilizar las mejoras como donantes para que sus crías las tengo otras. Cuanto mayor diferencial hay entre el valor de las crías que nacen y los vientres que las paren, más justificada estará esa inversión. De esta forma, se conseguirá una mayor rentabilidad.

Para realizar una transferencia de embriones, se necesita realizar un tratamiento hormonal para que se realice una superovulación. Una vez que se hace la recogida de embriones del útero, se transfiere en otras hembras. En el caso de la fecundación in vitro, se va un paso más allá, porque ya no dejamos que la oveja ovule ni críe sus embriones, sino que vamos directamente al ovario a aspirar los ovocitos que están dentro de los folículos. Se puede hacer con la oveja viva o se puede hacer incluso en el matadero con los ovarios de las ovejas recién sacrificadas. Esos ovocitos se fecundan en el laboratorio y pasan a incubadoras. Posteriormente, se pueden transferir a las receptoras.

El uso de las transferencias embrionarias en bovino está en aumento en todo el mundo. Se mantienen los datos de la tecnología embrionaria en vivo, que es la técnica que se utiliza en las ganaderías desde hace varias décadas, pero ha subido de forma considerable la tecnología in vitro.

La fecundación in vitro permite trabajar a más escala, lo que mejora la eficiencia económica del proceso y mejora los resultados, aunque son dos técnicas que se complementan.

En el caso del ganado ovino y caprino, teniendo en cuenta que los pequeños rumiantes ya son más prolíficos que las vacas, tenemos el potencial de aumentar mucho su capacidad de multiplicación con estas técnicas. De esta forma, se puede acelerar la mejora genética. La técnica en ovino implica dos laparoscopias con seis días de intervalo para inseminar y para sacar los embriones o una cirugía… y eso hace que la repetibilidad no sea tan alta porque tenemos que espaciar más los tratamientos. En este contexto, la tecnología in vitro ofrece alguna ventaja, ya que es menos intervencionista y agresiva, por lo que produce menos desgaste en las ovejas. Además, es repetible porque se pueden hacer muchos más procedimientos en cada oveja. Incluso se puede hacer un pool de varias ovejas. Con hembras especialmente valiosas, también se puede hacer rescate genético de una oveja que ha sufrido cualquier tipo de accidente.

La transferencia de embriones en ovino está aumentando en todo el mundo. Existen más laboratorios que están invirtiendo, incremento de materiales de fabricación de diseño y la inversión de materiales específicos, más cursos de reproducción y congresos… Los datos indican que la fecundación in vivo ha aumentado un 38,1% en ovino de 2020 a 2021, mientras que la fecundación in vitro ha aumentado un 344%, aunque debe tenerse en cuenta que venía de niveles muy bajos.

Ovigén lleva más de dos décadas intentando a difundir la mejora genética con la inseminación artificial, que tiene una fertilidad en ovino alrededor del 40%. En esta fertilidad influyen muchos factores, como el estado de la hembra, la edad de la hembra o la calidad de las dosis seminales. En este sentido, se están probando nuevos diluyentes que puede prolongar la vida útil del semen hasta 48 horas. Si conseguimos que esos diluyentes mejoraran la fertilidad, habría un repunte importante en la inseminación artificial, para que desde Ovigén se pudiera acceder a todas las zonas de la península Ibérica. En la actualidad, la distancia es un hándicap para la vida útil de los espermatozoides refrigerados. Está la alternativa de la laparoscopia, que cada vez se está utilizando más.

La primera fase de la producción de embriones en vivo es la estimulación ovárica de una hembra. Se estimula el ovario para producir muchos folículos… y que esos folículos den futuros embriones. Después de fertilizan, ya sea por monta natural o por inseminación artificial, y seis días después se recogen y se implantan en otras hembras que tengan una buena capacidad reproductiva.

Normalmente se hace por dos técnicas, por congelación o vitrificación. Esta última técnica es muy sencilla, pero tiene el inconveniente de que muchos países no aceptan embriones vitrificados en el comercio internacional, lo que obliga a congelar la congelación y la descongelación de embriones. También se puede hacer transferencia directa. Se tienen unas ovejas sincronizadas y se implantan a las receptoras en el mismo momento que se obtienen de la donante.

La superovulación es una estimulación ovárica para elevar la respuesta ovulatoria mediante inyecciones exógenas de FSH. Los inconvenientes son que los protocolos de ovino no están estandarizados, hay poca oferta terapéutica y limitada por el precio, hay respuestas individuales impredecibles y mucha variabilidad en las respuestas, como fracasos en la ovulación, luteinizacion de folículos, ovulaciones sin formación de cuerpo lúteo, regresión prematura de cuerpo lúteo o respuestas exacerbadas. Para reducir esa variabilidad en las respuestas, se puede sincronizar las ondas foliculares, realizar ecografías reproductivas, utilizar laparoscopia, determinar la progesterona sérica o realizar tratamientos superovulatorios personalizados.

Es fundamental sincronizar el momento de la ovulación con el momento de la fecundación, ya sea por monta natural o por inseminación artificial. Se recomienda hacer inseminación artificial laparoscópica para asegurar el momento óptimo de fecundación. Normalmente, las ovejas superovuladas ovulan antes que una oveja estimulada de una forma natural, lo que obliga a inseminar antes de las horas habituales.

La colecta de embriones es una técnica quirúrgica, lo que retrae al ganadero. Se necesita un equipo de tres personas: un técnico, un veterinario que realice la cirugía y una persona que controle de embriones. Es una técnica ligeramente traumática e invasiva, porque hay que extraer el aparato genital y requiere que los animales tengan un ayuno previo. Hay que anestesiarlos y existe riesgo de adherencias, ya que se trabaj en granjas que normalmente tienen polvo ambiental. Para mejorarlo, se intenta la recuperación no quirúrgica vía transcervical o laparoscópica. Posteriormente, se identifican los embriones que están fecundados y que son transferibles.

La transferencia de embriones también es quirúrgica. Hay que hacer una pequeña laparotomía, extraer el cuerno uterino e inyectar los embriones. Es una técnica poco traumática, pero requiere ayuno, tranquilización del animal y puede tener pequeñas complicaciones. Las mejoras son implantar los embriones por vía transcervical o laparoscópica.

Por lo que respecta a la conservación, normalmente se realiza una congelación clásica. Se requieren unos crioprotectores, para que no se formen cristales a la hora de enfriar el embrión. Estos cristales pueden romper los tejidos embrionarios, por lo que se tienen que utilizar de forma progresiva para que el embrión se vaya deshidratando, pierda el agua y no se formen esos cristales. A la hora de descongelarlos, también se tienen que retirar poco a poco los crioprotectores.

La experiencia de Ovigén ha permitió exportar embriones de Assaf y Lacaune, además de importar embriones de caprino o de Merino australiano que se han implantado en animales vivos. Es una técnica compleja y laboriosa y los resultados pueden ser erráticos, pero se debe seguir mejorando en la aplicación de la técnica.

La producción in vitro de embriones está formada por tres fases: maduración, fecundación y cultivo de embriones.

En primer lugar, se debe analizar la fuente de obtención del material genético. En el caso de los espermatozoides, las fuentes de obtención son los machos testados en Ovigén, las dosis seminales importadas o los machos de las ganaderías. En el caso de los ovocitos, se tienen dos fuentes de obtención, que es la opción del matadero para recuperar los ovocitos y la técnica laparoscópica LOPU. Esta técnica se utiliza mucho en vacuno y en pequeños rumiantes es muy compleja de realizar por motivos anatómicos del animal. La ventaja es que no necesitamos utilizar obligatoriamente un tratamiento hormonal, sino que se puede utilizar con la simple respuesta que tenga la hembra de manera natural. Evidentemente, si ponemos un tratamiento hormonal vamos a obtener una mayor respuesta y vamos a poder recuperar un mayor número de ovocitos, pero no es necesario y se puede repetir el tratamiento, además de una menor manipulación.

Para realizar la maduración, se necesitan seleccionar correctamente los ovocitos. Los ovocitos tienen unas células alrededor, que se conocen como las células del cúmulo, que son muy importantes durante el proceso de maduración y son una de las características que va a demostrar que el procedimiento ha ido correctamente. Además, presenta una maduración nuclear, produciéndose en una reanudación de la meiosis para que esos ovocitos puedan ser fecundados. También se produce una reorganización de las organelas internas.

El siguiente paso sería la fecundación in vitro. Puede realizarse con eyaculado en fresco, dosis seminales congeladas o procedentes del epidídimo, es decir, machos que han muerto, pero que se puede congelar el semen. Se realizan varios mecanismos de selección espermática para poder seleccionar los espermatozoides vivos móviles y con capacidad fecundante. Son esenciales los medios de cultivo. Tradicionalmente se han usado los ‘home-made’ en cada laboratorio, pero recientemente se han lanzado medios de cultivo comerciales para pequeños rumiantes.

La última fase del proyecto es el cultivo in vitro, que dura seis o siete días, con las condiciones controladas de temperatura, gases y humedad. No todos los ovocitos que se cultivan acaban siendo embriones, pero la realidad es que se producen. Es una técnica que está a la orden del día y que se puede realizar perfectamente. El equipamiento que se necesita es sencillo: cabina de flujo laminar, lupa binocelular, incubador con doble entrada de gas, equipo de aspiración folicular y microscopio de fluorescencia.

Finalmente, se tiene la opción de la transferencia en fresco o la congelación o vitrificación, para la exportación o la preservación del material genético.

Esta técnica puede llegar a ser el futuro de la exportación de la difusión de material genético, porque además tiene la ventaja de que puede realizarse en las ganaderías.

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