Las buenas prácticas son imprescindibles ante la ausencia de cultivos resistentes a CGMMV

El virus del mosaico verde jaspeado del pepino en España

Leticia Ruiz García¹, Óscar Crespo Romo¹, Maria Antonia Elorrieta Jove², Almudena Simón Martínez¹, M. Carmen García García¹ y Dirk Janssen¹¹IFAPA centro La Mojonera, Almería. Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural de la Junta de Andalucía ²Labcolor, Coexphal02/07/2018

El CGMMV (Virus del mosaico verde jaspeado del pepino) llama dos veces: en los últimos 25 años, dos cepas de diferente origen de este tobamovirus han entrado en los cultivos de cucurbitáceas del sur-este de España. Ambas se transmiten fácilmente por contacto, pueden permanecer en suelo durante largo tiempo, y probablemente han sido introducidos por semillas infectadas. Su control supone un nuevo reto para la producción hortícola bajo invernadero.

El Virus del mosaico verde jaspeado del pepino, o Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), es un tobamovirus que causa enfermedad en cultivos de cucurbitáceas en donde origina mosaico, moteado, clorosis e incluso abullonado de las hojas. Puede causar importantes pérdidas económicas ya que produce síntomas de deformación y mosaico en los frutos, especialmente en pepino (Figura 1). En particular en sandía, el virus causa un deterioro y licuado de la pulpa que adquiere un aspecto sanguinolento por lo que pierde todo su valor comercial. La enfermedad fue descrita por primera vez en España en los años 90 en cultivos de pepino en la provincia de Almería (Célix et al., 1996). A partir de ese momento, se han producido diversas alertas fitosanitarias en 2014, 2015 y 2017 por parte de la RAIF (Red de Alerta Fitosanitaria de Andalucía), o por el sector productivo ya en 2008 (Homo Agrícola, 2009). Además, desde hace unos años, la incidencia e importancia de este virus en la zona del sudeste español ha ido en aumento, encontrándose en áreas donde no se había registrado con anterioridad. El virus se transmite mecánicamente y por semilla, y como otros tobamovirus, CGMMV puede sobrevivir durante mucho tiempo en restos de cultivos vegetales (Reingold et al., 2015).

Figura 1: Síntomas de CGMMV en frutos de sandía (A), melón (B), y pepino (C-D).

Detección de dos razas de CGMMV

En los cultivos bajo plástico del sudeste de España se han identificado dos cepas distintas del virus. La primera cepa, que incluye el aislado tipo CGMMV-SP, ha sido detectado y sigue presente desde 1991 en invernaderos de Almería. Por otro lado, a partir del 2015 se ha detectado una segunda cepa, de origen asiático, inicialmente asociada a cultivos de los llamados pepinos “snack”. Esta cepa no solamente se ha detectado en Almería sino también en la provincia de Granada. Actualmente ambas cepas coexisten en un mismo territorio aunque parece ser que los aislados asiáticos están desplazando a los europeos (Crespo et al., 2017).

No es posible discriminar en el laboratorio las razas europeas y asiáticas mediante test serológicos en los que se utilizan anticuerpos específicos de antígenos virales. Esto se ha corroborado mediante el empleo de los test Immunostrip® (Agdia), que también utiliza anticuerpos específicos contra el virus. Para evaluar esto, se inocularon mecánicamente plántulas de pepino (cv Cum Laude de Fito) y calabacín (cv Victoria de Clause), ambos en estadío de 3 hojas verdaderas, con aislados pertenecientes a las razas europea y asiática de CGMMV. Después de 7, 14 y 21 días se tomaron muestras de hojas para su análisis según las instrucciones del fabricante. Los primeros síntomas atribuibles a CGMMV aparecieron a los 12 días dpi en plántulas de pepino. Las plantas de calabacín no mostraron ningún síntoma durante las tres semanas que duró el ensayo. Una semana después de la inoculación, y cuando todavía no se habían expresado síntomas del virus, los Immunostrips® dieron positivo para CGMMV tanto en las plántulas de pepino inoculadas con CGMMV-SP (raza europea) como CG-SPCu16 (raza asiática). Las plantas de calabacín inoculadas (descrito éste como huésped asintomático) tardaron dos semanas con respecto al pepino en resultar positivas al test, independientemente de la raza analizada.. Además, no se apreciaron diferencias significativas en cuanto a la intensidad de la reacción entre plántulas con una u otra raza (Figura 2).

Figura 2: Resultados a los 7 (A), 14 (B) y 21 (C) días post inoculación (dpi). SP: aislado de origen europeo (CGMMV-SP) 16: aislado de origen asiático (CG-SpCu16).

Aunque no hay diferencias claras entre los síntomas que inducen ambas razas en pepino, si existen determinadas diferencias biológicas en cuanto a los síntomas producidos por inoculaciones mecánicas en algunas plantas huésped. Por ejemplo, sólo la raza asiática es capaz de inducir lesiones locales en Chenopodium amaranticolor, mientras que la europea no produce ningún tipo de síntomas. Esta característica puede ser usada como test de diagnóstico rutinario y fácilmente reproducible. Por tanto, la expresión de los síntomas inducidos en esta planta huésped puede utilizarse para diferenciar los aislados tipo europeo de los aislados españoles de tipo asiático. El único inconveniente de este procedimiento es que el resultado se observa a partir de los 14 días, por lo que resulta algo tedioso y poco práctico.

Debido a esto, se ha desarrollado un método molecular más eficiente, basado en el análisis de las secuencias genómicas del virus.

Para diferenciar los aislados de CGMMV de la cepa europea y la asiática recogidos en el sudeste de España, se desarrolló una prueba de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) sobre productos de RT-PCR obtenidos con los cebadores que amplifican la región de la cápside del virus. En dichos productos se ha detectado la presencia de una secuencia diana para la enzima de restricción KpnI sólo en los aislados asiáticos. Así, al digerir los productos de amplificación con la enzima de restricción KpnI, se da lugar a dos fragmentos en los aislados asiáticos de 514 y 173 nucleótidos, permaneciendo el fragmento original de 687 nucleótidos, sin cortar, en el caso de los aislados europeos (Figura 3). Este protocolo ha sido utilizado con éxito en aislados de campo que muestran síntomas de CGMMV con independencia del origen del aislado, demostrando la fiabilidad y estabilidad del test y puede, por tanto, ser utilizado para la caracterización de nuevas infecciones de CGMMV que se detecten en los cultivos.

Figura 3: Análisis de RFLP con KpnI de productos de RT-PCR generados con los cebadores que amplifican para la cápside. Carril MW: marcador de peso molecular. Líneas 1 y 3: productos de amplificación no cortados de CGMMV-SP16 y CGMMV-SP (raza asiática y europea respectivamente). Carriles 2 y 4: productos de amplificación cortados de CGMMV-SP16 y CGMMV-SP.

Transmisión de virus en invernaderos

Para mejorar el conocimiento sobre los métodos de control de CGMMV en el sudeste de España, hemos estudiado la epidemiología del virus en la provincia de Almería. Entre los años 2013 y 2015, 154 cultivos protegidos de pepino (119), melón (21), sandía (13) y calabacín (1), en las provincias de Almería y Granada, fueron seleccionados al azar y analizados para la detección del virus. Para ello se recolectaron hojas de plantas de distintos puntos del invernadero para su análisis de CGMMV. Simultáneamente se recogió información detallada sobre el lugar, las características del invernadero, las prácticas culturales habituales y las prácticas normales de prevención y control de las enfermedades presentes o que hubiesen afectado anteriormente a dicho cultivo, y en concreto su histórico referente a la presencia del CGMMV.

Como resultado de los análisis realizados, se detectó CGMMV en 23 invernaderos, principalmente de pepino (20/119). Se determinó que la presencia de CGMMV era independiente del uso de plantas injertadas, del origen de las semillas y del tipo de cultivar, o del origen del agua de riego (pozos propios o comunes). Sin embargo, la infección si estaba relacionada en muchos casos de si hubo o no infecciones previas por CGMMV en las fincas o en el entorno de las mismas. Respecto a las prácticas habituales que se realizaban en los invernaderos que podrían influir en la epidemiología de este virus, en este estudio se mostró que rara vez se usaban guantes o desinfectantes para las manos y que tampoco es común limpiar periódicamente las estructuras de los invernaderos ni los reservorios de agua de riego. En cambio, y siempre según la encuesta, si es común la aplicación para el control del CGMMV de la desinfección de suelo por solarización, acompañándola de una rotación de cultivo con especies no susceptibles y por tanto que no pertenezcan a la familia de las cucurbitáceas (Elorrieta et al., 2017). Los seguimientos realizados en fincas con estas prácticas de solarización y rotación, junto con la eliminación controlada de los restos vegetales, mostraban que aunque no siempre se conseguía erradicar la enfermedad al menos se minimizaba su incidencia.

La importancia de ciertos parámetros en la epidemiología de este virus, como son rebrotes en las mismas fincas y/o zonas, nos hizo que comprobásemos experimentalmente la permanencia de CGMMV en distintos sustratos de cultivo. Durante dos campañas de otoño, se cultivaron plantas de pepino en 5 sustratos diferentes (perlita, lana de roca, fibra de coco, turba y arena). Las plantas fueron inoculadas manualmente y dejadas hasta final de cultivo. Los sustratos se mantuvieron en sus contenedores originales para volverlos a sembrar la campaña de primavera (marzo-junio) y estudiar la persistencia del virus en suelo (Figura 4). Cuando analizamos el progreso de la enfermedad de CGMMV sobre cada uno de los sustratos, observamos que aunque la permanencia de CGMMV en sustratos artificiales como perlita, fibra de coco y lana de roca es ligeramente mayor que en tierra y sustrato, estas diferencias no fueron significativas. Por tanto, se pudo concluir que CGMMV tiene una persistencia similar en los sustratos de cultivo comúnmente utilizados en la horticultura del sudeste español.

Figura 4: Plantas de pepino cultivadas en 5 sustratos diferentes (tierra, lana de roca, fibra de coco, perlita y turba).

También estudiamos la transmisión del virus en agua de riego, y determinamos que el 20% de las plantas regadas con agua proveniente de perlita infectada, y un 5% de las regadas con agua proveniente de tierra infectada fueron positivas a la infección por el virus durante la campaña de primavera. Ninguna infección se produjo durante la campaña de otoño. Por lo tanto, pudimos confirmar que los lixiviados provenientes de suelos infectados, pueden transmitir la enfermedad, y además que la temperatura parece tener un importante papel en la infección. La campaña de otoño, tradicional en el Sudeste de España para el cultivo del pepino, sería la más adecuada para facilitar un adecuado manejo del cultivo con probabilidad de ser infectado por CGMMV (Ruiz et al., 2014).

Profilaxis y control

El estudio realizado nos permite afirmar que realmente hace falta establecer unas mayores medidas de higiene desde la semilla hasta la mesa, desde el punto de vista de la sanidad del cultivo. Todo empieza en el uso de semillas libres de virus y por lo tanto en el control sanitario que los productores de semillas deben ejercer sobre las mismas. Quizás se deberían cambiar los límites para poder certificar con seguridad lotes que están ‘libres’ de CGMMV. Sigue en la acción en el semillero que debe utilizar dichas semillas libre de virus y usar prácticas que minimicen la dispersión de los mismos en caso de que los hubiera. Las plántulas infectadas no siempre muestran síntomas, pero en caso de sospechas, se deberían analizar, preferiblemente in situ, antes de salir de las instalaciones, bien con tests rápidos de campo como los Immunostrips, bien con análisis de laboratorio. Cuando se reutilizan bandejas, éstas deberían ser esterilizadas mediante vapor. Cada utensilio que llega a tocar plántulas debería ser desinfectado periódicamente. Además, los trabajadores deberían minimizar el contacto con plántulas, y en todo caso, desinfectar sus manos y zapatos.

Se debe mantener siempre un mismo sentido de trabajo dentro de un invernadero, y se deben minimizar los movimientos de equipos y personas entre invernaderos. Así mismo se debe tomar siempre máximas precauciones al entrar y al salir de un invernadero, dirigidas tanto a las personas como las herramientas utilizadas. También es importante que los trabajadores conozcan bien los síntomas de la enfermedad y alerten de la situación cuando sospechen de presencia de ellos, estableciendo zonas de cuarentena amplias, de varios líneos alrededor de la planta sospechosa. En dichas zonas no se debe trabajar, y de hacerlo, se debe hacer al final de la jornada, no tocando después las zonas aparentemente libres de virus. Finalmente, estas muestras deberían ser analizadas en un laboratorio para confirmación de la enfermedad y tomar medidas de contención. También es importante siempre eliminar y controlar malas hierbas.

En el caso de que se confirme la infección en un invernadero, sería importante retirar de forma controlada todos los restos vegetales, solarizar el suelo como mínimo durante los 3 meses de verano, mover la línea de siembra, cambiar o solarizar los sacos de hidropónico y desinfectar todo, incluido el sistema de riego. Además, se recomienda rotar cultivos usando doble línea de sacos, desinfectar las herramientas y guantes, crear zonas de cuarentena, y no hacer dos cultivos sucesivos de cucurbitáceas, especialmente no poner sandía después de un cultivo de pepino. Todas estas medidas son muy recomendables porque no hay cultivos resistentes a CGMMV disponibles para los agricultores. Se necesitan esfuerzos adicionales para guiar a los agricultores hacia buenas prácticas agrícolas con el fin de conseguir un buen control de este tipo de virus transmitidos por contacto.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por un proyecto de investigación RTA2012-00003-00-00 de INIA y FEDER. Leticia Ruiz tenía un contrato de investigación de IFAPA y el Programa Operativo FSE de Andalucía 2007-2013. ‘Andalucía se mueve con Europa’.

Referencias bibliográficas

Célix, A.; Luis-Arteaga, M.; Rodriguez-Cerezo, E. (1996). First report of Cucumber green mottle mosaic tobamovirus infecting greenhouse-grown cucumber in Spain. Plant Disease 80, 1303.

Crespo, O.; Janssen, D.; García, C.; Ruiz, L. (2017) Biological and Molecular Diversity of Cucumber green mottle mosaic virus in Spain. Plant Disease 101, 977-984.

Homo Agricola (2009) CGMMV. http://elhocino-adra.blogspot.com/2009/08/cgmmv.html

Elorrieta M.A.; Ruiz, L.; Janssen. D. (2017) Epidemiology and control of Cucumber green mottle mosaic virus in Spain. Phytopathologia Mediterranea 56, 358-358.

Reingold, V.; Lachman, O.; Belausov, E.; Koren, A.; Mor, N.; Dombrovsky, A. (2015). Epidemiological study of Cucumber green mottle mosaic virus in greenhouses enables reduction of disease damage in cucurbit production. Annals of Applied Biology 168, 245-255.

Ruiz, L.; Simón, A.; García-García, M.C.; Pascual, F; Janssen, D. (2014). Transmisión del Virus del Mosaico Verde Jaspeado del Pepino en Sustratos de Cultivo. Publicación SERVIFAPA http://www.juntadeandalucia.es/agriculturaypesca/ifapa/servifapa/contenidoAlf?id=714e68d1-ec50-4921-8d07-649924bd06b4