Para prevenir Salmonella y norovirus en la producción y procesado es importante una correcta aplicación de Buenas Prácticas Agrícolas (BPA), Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) por parte de los productores

Una década después de la publicación del informe de la EFSA (2014) que señaló el riesgo asociado a la presencia de Salmonella spp. y Norovirus en frutos rojos, se continúa notificando su presencia en estos frutos. El objetivo de este trabajo fue desarrollar el recubrimiento comestible RP-7 capaz de reducir la población de Salmonella enterica y Norovirus murino en fresas congeladas. Su aplicación redujo la población de S. enterica más de 2,5 logaritmos en la primera semana en congelación y alcanzó recuentos por debajo del límite de detección (1 log ufc/fresa) en la octava semana. Para Norovirus, se redujo su población casi 2 logaritmos en la octava semana. Por lo tanto, la aplicación de RP-7 es una alternativa efectiva para reducir la población de S. enterica y Norovirus en fresa congelada.

La fresa es una fruta muy apreciada por los consumidores que contiene compuestos fenólicos relacionados con la inhibición de la proliferación de células cancerígenas y la mejora de la salud cardiovascular (Mortas & Sanlier, 2017). Estos beneficios asociados a su consumo podrían ser algunas de las razones por las que su producción se ha incrementado un 10,15% en los últimos años, llegando a 346.484 t, ocupando 7.328 ha de cultivo, siendo España uno de los principales países productores de la Unión Europea (MAPA, 2023).

Sin embargo, las fresas son muy susceptibles a alteraciones microbianas, por lo que tienen una vida útil muy corta. La congelación de este tipo de fruto ha permitido consumir fresas en su óptimo estado de madurez fuera de temporada y lejos de la zona de producción. Para ello se puede aplicar la criocongelación, en que el alimento contacta con nitrógeno líquido o dióxido de carbono produciéndose un descenso de temperatura muy rápido. De esta manera se consiguen alimentos con una textura muy similar a la original y que conservan las mismas características organolépticas y nutricionales que los productos frescos.

En 2014, la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2014) publicó un informe remarcando el riesgo asociado a la presencia de Salmonella spp. y Norovirus en frutos rojos, en los que se incluían las fresas. Entre algunas de las recomendaciones finales, se indicó la necesidad de realizar muestreos específicos sobre la presencia de Norovirus en diferentes tipos de frutos rojos, en producción primaria, después del procesado mínimo (incluyendo congelación) y en el punto de venta. Las fuentes de contaminación de las bayas por Salmonella y Norovirus son muy similares. A pesar de estar poco documentada, está influenciada por aspectos ambientales (proximidad con granjas de animales y condiciones climáticas), el uso de estiércol o abono sin tratar, la utilización de agua para fines agrícolas contaminada y la contaminación cruzada por manipuladores y equipos de cosecha.

Para prevenir Salmonella y norovirus en la producción y procesado es importante una correcta aplicación de Buenas Prácticas Agrícolas (BPA), Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) por parte de los productores. Aunque Ortiz-Solà et al. (2020) no detectó presencia de estos patógenos en fresas producidas en España, desde 2020 se han producido 14 alertas alimentarias a nivel europeo por la presencia de virus (Norovirus y Hepatitis A) o Salmonella spp. en fruta tipo baya (RASFF, 2024). Estas alertas evidencian que las recomendaciones de la EFSA no fueron las suficientes como para garantizar la seguridad microbiológica de estos alimentos. Es por ello que se hace necesario aplicar una nueva barrera que complemente a las anteriores y que permita a la industria alimentaria reducir la población de estos patógenos en frutas congeladas, en el caso que pudieran estar presentes y a su vez que sean aceptadas por el consumidor. El uso de substancias antimicrobianas, como por ejemplo los aceites esenciales, puede controlar el crecimiento de microrganismos patógenos (Scientific Committees, 2024) durante la vida útil del producto.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un prototipo de recubrimiento comestible (RP-7), formulado a base de una pectina obtenida de subproductos de la industria alimentaria y de aceites esenciales, con capacidad antimicrobiana para minimizar el riesgo microbiológico asociado a Salmonella enterica y Norovirus murino en fresas congeladas.

1. Preparación del material vegetal y recubrimiento

Se usaron fresas (Fregaria x ananassa) obtenidas de distribuidores locales que se almacenaron a 4°C hasta la realización de los ensayos. Los ingredientes principales del recubrimiento RP-7 son una pectina revalorizada (Cargill; E-440) y dos aceites esenciales (carvacrol y citral). El recubrimiento se preparaba en el laboratorio el día anterior a su aplicación.

2. Producción de microorganismos

El efecto antimicrobiano del recubrimiento RP-7 se estudió frente a un cóctel de tres cepas de S. enterica (Montevideo (ATCC BAA-710), Gaminara (ATCC BAA-711) y Enteritidis (CECT 4300)) y frente a Norovirus murino (MNV-1).

3. Experimentación en fresa

Las fresas se inocularon con el cóctel de S. enterica o con el stock de Norovirus murino para obtener una concentración de 10⁶ ufc/fresa. Una vez inoculadas, las fresas se mantuvieron en refrigeración hasta el día siguiente.

El día del ensayo, las fresas de recubrieron mediante inmersión en un baño de RP-7. A continuación, se dejaron secar durante 45 minutos a 4°C. Las fresas control, no se recubrieron, pero se dejaron el mismo tiempo en refrigeración. Tras el tiempo de secado, las fresas se congelaron por contacto con nitrógeno líquido durante 30 minutos y se conservaron a -20°C durante 8 semanas.

Para determinar la concentración de S. enterica en la fresa, las frutas, directamente congeladas, se colocaron individualmente en una bolsa estéril con agua de peptona tamponada (APT; Biokar, Beauvis, Francia) a la que se aplicó fricción durante 90 segundos. A continuación, se realizó una serie de diluciones decimales en peptona salina (PS; 8,5 g/L de NaCl y 1 g/L de peptona) y se sembró en medio XLD agar, selectivo para el recuento de S. enterica (XLD; Biokar, Beauvis, Francia).

En el caso de Norovirus, los recuentos se realizaron de forma homóloga utilizando TGBE (12,1 g/L de Tris base, 3,8 g/L de glicina y 10,0 g de extracto de carne) como diluyente. A continuación, se centrifugó el diluyente y se tituló el sobrenadante utilizando células RAW 264,7.

4. Aceptación visual

Para avaluar el efecto de la aplicación del recubrimiento RP-7 en el aspecto de fresa congelada se realizó un ensayo en planta piloto utilizando una cámara de congelación criogénica que se enfría inyectando nitrógeno líquido (N₂) en su interior (Carburos Metálicos-Air Products Group modelo Batch Freezer CM-85/1090). Para ello, las fresas se lavaron y la mitad de ellas se recubrieron con RP-7. Tras al secado del RP-7, la fruta se criocongeló y se almacenó durante un mes a -20 °C. Pasado ese tiempo, las fresas se descongelaron y se realizó una evaluación del aspecto visual por 50 jueces no entrenados utilizando una escala hedónica de 9 puntos (siendo 1 me disgusta mucho y 9 me gusta mucho). El aspecto de las fresas se comparó con fresas congeladas comerciales que se descongelaron de forma análoga a las congeladas en planta piloto.

5. Tratamiento de datos y análisis estadístico

Los resultados microbiológicos se transformaron a logaritmo decimal (log ufc/fresa). Cuando las bacterias no pudieron contarse, pero se detectaron tras el enriquecimiento, los resultados se expresaron como presencia por debajo del límite de detección (1 ufc/mL). Cuando el patógeno no pudo contarse y tras el enriquecimiento tampoco se detectó, los resultados se expresaron como no detección. Todos los resultados se analizaron utilizando el programa estadístico JMP Pro-17 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Los datos obtenidos han sido tratados por un test de análisis de varianza (ANOVA) para calcular las diferencias significativas entre los resultados. Para observar estas diferencias se aplicó el test de Tukey Honest Significant Difference (HSD) por promedios. El criterio de nivel de significación fue de p<0,05. También se utilizó el test de t-student con el nivel de significancia de p<0,05.

1. Efectividad de la aplicación de RP-7 frente a S. enterica en fresa congelada

La concentración de S. enterica inoculada en fresa sin recubrimiento fue de 5,9 ± 0,4 log ufc/fresa (Figura 1). A tiempo 0 (justo después de la congelación), la población de S. enterica en las fresas con RP-7 fue 2 unidades logarítmicas inferior al control. A lo largo de la conservación en congelación la población de la bacteria se mantuvo constante en las fresas sin recubrimiento, mientras que en las fresas con RP-7 la población de S. enterica disminuyó de forma importante con reducciones superiores a las 2 unidades logarítmicas respecto el control, llegando a una población inferior al LD tras 8 semanas a -20°C.

Figura 1. Población de S. enterica inoculada artificialmente en fresas sin recubrimiento (Control) y con recubrimiento (RP-7) conservada a -20°C. Las letras indican las diferencias significativas entre tiempos para cada tratamiento según la prueba HSD de Tukey (p < 0,05). Los asteriscos (*) muestran diferencias significativas entre los dos tratamientos a un tiempo dado según la prueba de t-student (p < 0,05).

Diversos autores han descrito el efecto antimicrobiano de los aceites esenciales. Por ejemplo, Cabarkapa et al. (2019) observaron como el carvacrol reducía la capacidad de formación de biofilms de tres cepas de S. Typhimurium. En otro estudio, la aplicación de aceites esenciales encapsulados en combinación con los ultrasonidos en tomates ‘cherries’ frescos redujeron significativamente la población de Salmonella (Su et al., 2023). Por otro lado, la combinación de antimicrobianos ha mostrado tener un efecto sinérgico (Shi et al., 2016). La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales está asociada con su estructura química que puede alterar la permeabilidad de la membrana celular y producir muerte celular.

2. Efectividad de la aplicación de RP-7 frente a Norovirus murino en fresa congelada

En el caso de Norovirus murino, la aplicación de RP-7 redujo su población a partir de la primera semana de congelación, donde se observó que hay diferencias significativas entre la población en las fresas control y las fresas con RP-7 (Figura 2). Asimismo, la población en las fresas control se mantuvo por encima de la población de las fresas con RP-7 durante las ocho semanas de congelación con poblaciones por encima de los 5 logaritmos upf/fresa. Por el contrario, en las fresas con RP-7 se observó una disminución de población de 2,1 unidades logarítmicas entre el tiempo 0 y la octava semana.

Figura 2. Población de Norovirus murino inoculado artificialmente en fresa sin recubrimiento (Control) y con recubrimiento (RP-7) conservada a -20°C. Las letras indican las diferencias significativas entre tiempos para cada tratamiento según la prueba HSD de Tukey (p < 0,05). Los asteriscos (*) muestran la existencia de diferencias significativas entre los dos tratamientos a un tiempo dado según la prueba de t-student (p < 0,05).

Los mecanismos de acción de los aceites esenciales para inactivar a Norovirus son variados. Por ejemplo, Gilling et al., (2014) observaron que el citral no degradaba la cápside del virus, sino que incrementaba de tamaño por una unión entre la substancia y la cápside. Esta unión podría afectar a la capacidad infectiva del virus. Otros autores han observado como la aplicación de un recubrimiento a base de té verde redujo la población de norovirus murino en más de 2 unidades logarítmicas tras 24 h a 10°C (Falcó et al., 2019). En nuestro caso, al cabo de las ocho semanas conseguimos una reducción de más de 2 unidades logarítmicas. El mayor tiempo necesario para conseguir la misma reducción puede deberse a que las freses se han conservado en congelación, temperatura a la cual el virus queda latente y está protegido de la acción de los aceites esenciales.

3. Aceptación visual

No se observaron diferencias significativas entre la aceptación visual de las fresas control y las fresas recubiertas con RP-7 tras la descongelación (Figura 3). Sin embargo, las fresas comerciales obtuvieron una puntuación significativamente inferior. Visualmente las fresas comerciales obtuvieron 3,9 ± 1,8 puntos. En cambio, el control y el RP-7 superaron los dos casos los 7 puntos. Por lo tanto, la aplicación de RP-7 no afectó significativamente la aceptación visual del consumidor. En cambio, la criocongelación realizada en planta piloto tuvo un efecto positivo en el aspecto de las fresas tras su descongelación.

Figura 3. Aceptación visual de fresas descongeladas sin recubrimiento (Control), con recubrimiento (RP-7) y comercial (CO) tras un mes de conservación a -20°C. Las letras indican las diferencias significativas entre tiempos para cada tratamiento según la prueba HSD de Tukey (p < 0,05).

Los resultados de este estudio demuestran la actividad antimicrobiana del recubrimiento comestible RP-7. En el caso de S. enterica, la aplicación de RP-7 redujo significativamente la población del patógeno a tiempo inicial en comparación con el control. Respecto a Norovirus la aplicación del RP-7 redujo la población más de 2 unidades logarítmicas respecto el control. Asimismo, la aplicación del RP-7 no afectó a la aceptación visual de las fresas tras su descongelación. Por lo tanto, la aplicación del prototipo de RP-7 puede ser una alternativa eficaz para mejorar la seguridad alimentaria y calidad de fresas congeladas.

Agradecimientos

Actividad financiada a través de la operación 01.02.01 de Transferencia Tecnológica del Programa de desarrollo rural de Cataluña (2014-2022). Los autores agradecen también la colaboración en la financiación a Carburos Metálicos-Grupo Air Products.

BIBLIOGRAFÍA

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