Nuevas metodologías para el diagnóstico ante-mortem de la tuberculosis bovina, ¿tienen futuro?

La tuberculosis (TB) bovina está producida por micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC), siendo el agente principal Mycobacterium bovis (M. bovis) (Cousins, 2001, Schiller et al., 2011). Debido a las repercusiones sanitarias y económicas de la TB, esta enfermedad está sometida a programas de erradicación en diversos países, entre ellos España (MAPA 2023). Estos programas se basan, entre otras medidas, en una estrategia de diagnóstico y sacrificio de los animales reactores a las pruebas oficiales de diagnóstico ante-mortem de TB.

En ganado bovino estas pruebas son son la intradermotuberculinización (IDTB), también conocida como “prueba de la tuberculina”, y el ensayo de liberación de interferón-gamma (IGRA) o “prueba de interferón-gamma” (IFN-γ) (MAPA 2023). La IDTB consiste en la inoculación intradérmica en las tablas del cuello de la tuberculina o PPD, un derivado proteico purificado obtenido a partir de una cepa de M. bovis (tuberculina bovina, empleada en la IDTB simple) o de una cepa de M. avium (tuberculina aviar, empleada conjuntamente con la anterior en la IDTB comparada).

La administración de este compuesto desencadena una reacción inflamatoria local en los animales infectados por la bacteria que es evaluable por el veterinario, siendo la prueba más empleada para el diagnóstico de TB en rumiantes domésticos.

El empleo de la IDTB ha permitido erradicar la TB bovina en diversos países. En España, algunas Comunidades Autónomas también han podido alcanzar el estatus de oficialmente indemne, como es el caso de Canarias, Cataluña, Galicia, Islas Baleares, Asturias, Murcia o País Vasco (MAPA 2023). 

A esta situación también ha contribuido en gran medida el empleo de la prueba de IFN-γ de forma combinada con la IDTB, ya que la utilización conjunta de ambas técnicas permite maximizar la detección de animales infectados. Sin embargo, el diagnóstico de la TB es difícil, debido fundamentalmente a la compleja respuesta inmunitaria que se desarrolla tras la infección, a los fenómenos de latencia y enfermedad, que no están bien caracterizados en animales, y a las co-infecciones con otras micobacterias.

Estos y otros factores pueden afectar al rendimiento de las técnicas diagnósticas, las cuales son a su vez sensibles a variaciones en los procedimientos, lo que exige una formación previa que garantice que se realizan e interpretan adecuadamente (Bezos et al., 2014; Crozet et al., 2019). Esta situación conlleva que la mejora del diagnóstico de TB sea una de las líneas de investigación prioritaria y en la que más estudios se están realizando, suponiendo un verdadero desafío por las dificultades anteriormente mencionadas.

Gran parte de las investigaciones realizadas hasta la fecha han estado enfocadas a la evaluación y mejora del funcionamiento de las técnicas oficiales anteriormente descritas, ya sea para definir su rendimiento en diferentes situaciones epidemiológicas o para valorar el efecto de posibles modificaciones técnicas en este.

En este sentido, se han evaluado antígenos más específicos que podrían ser una alternativa a la tuberculina oficial en el futuro, el efecto que tiene el punto de inoculación en el resultado de la IDTB o el efecto que tiene el tiempo transcurrido entre la toma de muestras de sangre y su estimulación posterior en la prueba de IFN-γ.

Todos estos estudios han permitido mejoras de los protocolos y del rendimiento de las pruebas oficiales de diagnóstico (Casal et al., 2015; de Lisle et al., 2017; Middleton et al., 2021). Más allá de mejorar lo que está disponible, otros estudios se han centrado en desarrollar técnicas nuevas o plataformas diagnósticas que pudieran ser un complemento de las pruebas oficiales o incluso sustituirlas si el rendimiento demostrado fuese el adecuado, lo que permitiría ampliar el abanico de herramientas y estrategias diagnósticas para lograr la erradicación de la enfermedad en un futuro. Precisamente en algunas de estas técnicas surgidas o evaluadas en los últimos años queremos centrar el presente artículo.

El conocimiento de la compleja respuesta inmunitaria frente a la TB y su relación con el diagnóstico ha sido la piedra angular de multitud de trabajos científicos debido a su aplicación directa en los programas de erradicación de la TB. Para lograr que las pruebas tengan una precisión máxima en la diversidad de contextos en los que se encuentran nuestras explotaciones, es necesario mejorar nuestro conocimiento acerca de la respuesta inmunitaria del huésped e investigar en nuevas metodologías que nos permitan una óptima diferenciación de los animales infectados y no infectados.

• Técnicas de detección de anticuerpos

Las técnicas basadas en la detección de anticuerpos específicos (respuesta inmune de base humoral) frente a antígenos de las micobacterias tuberculosas, emergieron como una herramienta complementaria en el diagnóstico de TB bovina. Es necesario remarcar que, por norma general y a diferencia de lo que sucede con la respuesta de base celular, la respuesta inmune de base humoral frente a la TB no es intensa en la fase inicial de la enfermedad, alcanzándose niveles elevados de anticuerpos en fases más avanzadas (Pollock & Neill, 2002) (figura 1).

En principio, las técnicas de detección de anticuerpos no permitirían un diagnóstico precoz de la TB y, por esta razón, actualmente no han sido contempladas como una prueba oficial en los programas de erradicación. Sin embargo, a medida que nuestro conocimiento sobre la respuesta inmunitaria frente a la TB se sigue ampliando y las técnicas de detección de anticuerpos van mejorando, estas podrían tener gran potencial en el futuro para determinadas situaciones específicas como por ejemplo, ante la presencia de animales en estados avanzados de infección y/o con la inmunidad celular alterada (comúnmente conocidos como anérgicos), que no responderían convenientemente a las pruebas diagnósticas oficiales como la IDTB o la prueba de IFN-γ (Bezos et al., 2018).

Figura 1. Representación esquemática de la evolución de la respuesta inmune frente a tuberculosis en el tiempo. En una etapa inicial los animales infectados reaccionarían a las técnicas de base celular, IDTB e IFN-γ. En una fase posterior, se produce un descenso de la reactividad de estas técnicas en paralelo a un incremento de la reactividad de las técnicas basadas en la detección de anticuerpos dando lugar al estado denominado como anergia a la par que incrementa la severidad de las lesiones. Imagen adaptada del estudio Pollock y Neill, 2002. Fuente: Visavet.

El diagnóstico de base humoral de la TB permite detectar anticuerpos específicos frente a algunas de las proteínas micobacterianas más reactivas como ESAT-6, CFP-10, MPB83 o MPB70 (Bezos et al., 2014; Wiker, 2009). En esta línea, existe un gran interés por la P22, un complejo proteico altamente específico obtenido a partir de la inmunopurificación de la PPD bovina y que incluye las cuatro dianas anteriormente mencionadas (Infantes-Lorenzo et al., 2017). Este complejo ha sido testado experimentalmente en el diagnóstico humoral de TB tanto en bovino como en otros rumiantes domésticos (Infantes-Lorenzo et al., 2019) y otras especies animales domésticas y salvajes (Infantes-Lorenzo et al., 2019; Thomas et al., 2019). La principal ventaja de usar este complejo proteico en el diagnóstico humoral es su elevada especificidad, pudiendo reducir así las reacciones frente a algunas micobacterias no tuberculosas o micobacterias ambientales que pudieran interferir en el diagnóstico de la TB (Infantes-Lorenzo et al., 2017).

Como técnica, el diagnóstico humoral presentaría numerosas ventajas económicas y logísticas en el caso de poder utilizarse como alternativa a las pruebas oficiales en el futuro. A diferencia de la IDTB, el empleo de estas técnicas reduce las complicaciones asociadas al manejo de los animales al requerir ser manipulados tan solo en una ocasión, con la consiguiente disminución del estrés y mejora del bienestar animal. Por otro lado, al no necesitar de una estimulación antigénica como sí ocurre en la IDTB con la aplicación de las PPDs, la técnica podría repetirse sin necesidad de establecer plazos por la posible alteración de los resultados (Coad et al., 2010). También es destacable que, en explotaciones de difícil acceso o sin laboratorios cercanos, la detección de anticuerpos puede presentar ventajas con respecto a la prueba de IFN-γ ya que, a diferencia de ésta, las muestras no requieren de una estimulación antigénica previa a la técnica tras su recogida (Bezos et al., 2014). Finalmente, otra ventaja destacable que presentan estas técnicas es que algunos formatos como el ELISA admiten generalmente diferentes tipos de muestras como suero o plasma (Casal et al., 2017), leche (Buddle et al., 2013; Zhu et al., 2022) o incluso orina y saliva (Lyashchenko et al., 2021), permitiendo un análisis rápido y en un gran número de muestras de forma simultánea. En definitiva, los prometedores resultados de los trabajos de investigación y las ventajas expuestas anteriormente podrían anticipar la implementación de estas técnicas como método diagnóstico efectivo de la TB en determinadas situaciones epidemiológicas en un futuro próximo.

• Plataformas experimentales para la detección de citoquinas

Las citoquinas son proteínas de bajo peso molecular implicadas en la regulación de la respuesta inmunitaria (Etna et al., 2014). Es necesario remarcar que las citoquinas pueden entenderse como señalizadores del estado inmunitario de un animal, del estado de infección o latencia de este, o de su respuesta frente a la vacunación, entre otros, de ahí el interés práctico por su estudio, detección y cuantificación. Aunque la detección de citoquinas específicas ya se emplea en la actualidad para el diagnóstico oficial en la prueba de IFN-γ (MAPA, 2023), las nuevas líneas de investigación se orientan hacia metodologías que mejoren a las técnicas actuales o que amplíen el abanico de citoquinas detectables para lograr un mejor rendimiento en términos de sensibilidad y especificidad (Smith et al., 2021; Steinbach et al., 2019).

Una de las técnicas experimentales empleadas en la detección de IFN-γ es el ELISpot, un ensayo de base inmunitaria que puede aplicarse para la detección de diferentes citoquinas en sangre previamente estimulada con antígenos específicos, de forma similar a la prueba de IFN-γ. La principal ventaja de este sistema es su gran sensibilidad, razón por la que se ha empleado de forma experimental para el diagnóstico de la TB, permitiendo incluso clasificar correctamente a los animales tuberculosos de forma más temprana que la prueba de IFN-γ, (Li et al., 2022).

Además del IFN-γ, existen otras citoquinas interesantes hacia las que se dirigen algunos estudios de investigación de la TB bovina en la actualidad, como la IL-2. Esta es una citoquina pro-inflamatoria secretada por los linfocitos en la respuesta inmune frente a las micobacterias (Whelan et al., 2011) y cuyo interés en la detección radica en que es considerada un importante biomarcador de infección, pero también de presencia de lesiones compatibles con TB, de una forma más específica incluso que el IFN-γ (Steinbach et al., 2019).

Ciertos estudios de investigación han tratado de implementar la detección de la IL-2 mediante diferentes técnicas en el laboratorio, incluyendo la citometría de flujo (Xia et al., 2020). En este estudio se pudo demostrar la relevancia de la IL-2 como biomarcador de TB determinando mediante citometría de flujo que existía una mayor producción de esta citoquina en animales con TB en comparación con aquellos que estaban sanos (Xia et al., 2020). Además, mediante esta metodología se pudo diferenciar entre animales infectados de TB y animales expuestos a micobacterias no tuberculosas (El-Naggar et al., 2015). Este último hallazgo podría tener gran utilidad práctica, ayudando a desarrollar metodologías para mitigar las interferencias diagnósticas que pueden provocar algunas micobacterias no tuberculosas en las pruebas diagnósticas oficiales contempladas en el programa de erradicación (Álvarez et al., 2008). Aunque estos hallazgos son muy interesantes y a día de hoy la citometría de flujo se emplea para diagnóstico en medicina humana (Clift, 2015), su aplicación en el diagnóstico rutinario a gran escala parece difícil en sanidad animal, debido especialmente al coste del equipamiento y la necesidad de un personal altamente especializado para su manejo (El-Naggar et al., 2015).

Sin embargo, el diagnóstico de TB basado en la detección de otras citoquinas parece prometedor y, por ello, las líneas de investigación actuales trabajan en plataformas con aplicación a gran escala y sin grandes requerimientos técnicos que permitan detectar múltiples citoquinas de forma simultánea (Smith et al., 2021; Steinbach et al., 2021; Wang et al., 2018), las cuáles derivan de estudios previamente realizados en diagnóstico de TB en humanos (La Manna et al., 2018). Estas nuevas metodologías basadas en tecnología tipo Luminex evalúan el perfil de expresión de diferentes citoquinas en individuos con diferente estatus de infección, permitiendo así, por ejemplo, determinar diferencias en los patrones de expresión entre aquellos individuos con infección latente o enfermos (La Manna et al., 2018; Tincati et al., 2012; Wang et al., 2018; Steinbach et al., 2021). Esto último podría ser de gran utilidad para maximizar la detección de aquellos animales con infecciones latentes que no expresen determinados marcadores y que presenten una reactividad anómala en las pruebas diagnósticas oficiales (IDTB y prueba de IFN-γ), permitiéndonos, por tanto, eliminar a aquellos animales que podrían convertirse en focos silenciosos de infección, diseminando la enfermedad a nivel del rebaño o entre explotaciones (Pollock & Neill, 2002).

• Empleo de bacteriófagos para el diagnóstico de la TB bovina

El empleo de bacteriófagos en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ya comenzó a finales del siglo pasado, por ejemplo, para el diagnóstico de la salmonelosis (Hirsh & Martin, 1983a, 1983b). El fundamento de este método comprende el uso de un virus bacteriano (bacteriófago) que infecta de forma específica a las micobacterias viables de una muestra, consiguiendo introducirse dentro de ellas. En este momento, el bacteriófago utiliza la maquinaria celular de la micobacteria para producir nuevas partículas víricas que se acumulan en el interior de esta hasta que consiguen salir al exterior para infectar nuevas micobacterias. La supervivencia del bacteriófago depende, por tanto, de la existencia previa de micobacterias vivas en la sangre o tejidos de los animales, lo cual podría emplearse como indicador de infección (Botsaris et al., 2016; Jones et al., 2020; Swift et al., 2020).

El desarrollo y evaluación de esta técnica en el diagnóstico de la TB no estuvo exenta de polémica, ya que asumía que la mayor parte de los animales infectados de TB (incluyendo incluso aquellos con infección latente) tenían micobacterias en sangre circulante, lo que rompía con el paradigma que se tenía de la enfermedad (Maggioli, 2016). Existen pequeñas variantes en el diagnóstico con bacteriófagos en función de cómo se produce su detección al final de la técnica: algunos ensayos detectan la fluorescencia emitida por bacteriófagos (Jones et al., 2020), en otros el resultado se revela a simple vista mediante cambios físicos en un medio de cultivo (Swift et al., 2016) y en algunos, más novedosos y específicos, se emplea una prueba molecular confirmatoria tipo PCR, como es el caso del test comercial Actiphage (Swift et al., 2020).

Algunas de las ventajas que presenta esta técnica radican en permitir un diagnóstico ante-mortem relativamente rápido (ya que tan solo se necesitarían entre 24 y 48 horas) pero también en la variedad de muestras que admitiría, como sangre, heces, saliva, tejidos, leche (y derivados), permitiendo un diagnóstico temprano y a diferentes niveles (Beinhauerova & Slana, 2021; Swift et al., 2013). Sin embargo, en estudios no publicados realizados en condiciones de campo se han obtenido sensibilidades más bajas de las inicialmente atribuidas a la técnica, posiblemente debidas al factor antes mencionado relativo a la poco probable presencia de micobacterias en sangre circulante de animales infectados.

• La resonancia magnética nuclear y su aplicación en el diagnóstico de la TB bovina

Otra de las líneas experimentales seguidas en los últimos años con el objetivo de mejorar el diagnóstico de TB bovina ha sido la metabolómica, el estudio de unas sustancias de diferente naturaleza denominadas metabolitos, presentes en las células y los tejidos y que actúan a modo de marcadores de infección. Estos estudios novedosos emplean la resonancia magnética nuclear (RMN), gracias a la cual se detecta la presencia de estos metabolitos en fluidos biológicos de los animales (suero y plasma principalmente), de tal modo que se puedan elaborar patrones de presencia que permitan diferenciar entre animales infectados y sanos (Snowden et al., 2012). Recientemente, ciertos trabajos de investigación han evaluado esta técnica para el estudio de la TB bovina (Ruiz-Cabello et al., 2022), la TB en animales silvestres (Bauman et al., 2022) y la paratuberculosis (PTB) (De Buck et al., 2014).

En lo relativo a la TB bovina, aunque los estudios hasta la fecha han sido escasos, los resultados obtenidos han sido prometedores, diferenciando entre animales con TB y animales sanos con gran precisión en muestras de suero o plasma y sin requerir estimulación antigénica previa. Además, la RMN, al no tener base inmunológica y poder detectar un amplio abanico de metabolitos que se producen durante el transcurso de la TB (los cuales son modificables con base a diferentes criterios), sería potencialmente capaz de detectar animales en diferentes fases de la infección/enfermedad o aquellos animales tuberculosos con respuestas inmunitarias alteradas que no reaccionan a las pruebas diagnósticas oficiales (Ruiz-Cabello et al., 2022).

Otra gran ventaja de esta técnica está relacionada, de nuevo, con las micobacterias no tuberculosas. Estas micobacterias son causantes de enfermedades en los bovinos como por ejemplo la PTB, a las que se les atribuyen interferencias en el diagnóstico de TB (motivo por el cual, por ejemplo, la vacunación frente a PTB se encuentra prohibida en ganado bovino) (Roy et al., 2018). Si bien, en un estudio experimental en ganado bovino en el que la RMN permitió diferenciar de forma precisa animales con TB de los sanos, también permitió diferenciarlos de los vacunados de PTB (Ruiz-Cabello et al., 2022), gracias a los diferentes patrones de presencia de metabolitos (figura 2). Estos resultados han suscitado un gran interés, al convertirse en una potencial herramienta potencial para el diagnóstico ante-mortem rápido y efectivo de TB incluso en futuros escenarios en los que la vacunación de PTB estuviese permitida. Sin embargo, no debemos olvidar que estos estudios preliminares han sido realizados en un número limitado de animales y sería necesario ampliarlos bajo diferentes situaciones epidemiológicas para poder determinar el rendimiento real de esta técnica como herramienta diagnóstica de TB bovina. Además, de momento, el empleo de RMN requiere de laboratorios técnicamente dotados y de personal altamente cualificado para realizar e interpretar el ensayo (Ruiz-Cabello et al., 2022).

Figura 2. Representación gráfica (R software) del análisis de discriminación de ganado bovino infectado de tuberculosis (rojo) y sano (verde) con base al espectro obtenido a partir del plasma analizado mediante resonancia magnética nuclear de campo bajo (LF-NMR, izquierda) y alto (HF-NMR, derecha). Para el análisis se tienen en cuenta dos componentes (Component 1 y 2) que se constituyen por los denominados loadings (cambios en la composición química) y scores (concentración de los metabolitos). Imagen extraída del estudio de Ruiz-cabello et al., 2021.

En conclusión, los resultados de algunas de las metodologías diagnósticas descritas en el presente artículo y que han emergido en los últimos años han suscitado el interés de la comunidad científica, que sigue trabajando en su optimización. Las plataformas basadas en la detección de múltiples citoquinas simultáneamente parecen una de las opciones más prometedoras para lograr un mejor rendimiento diagnóstico, pues incluyen marcadores específicos que se expresan en animales con infección latente que podrían no reaccionar convenientemente a las pruebas oficiales y transmitir la infección de manera silenciosa. Aunque en muchos casos las técnicas descritas presentan limitaciones científico-técnicas, el rápido avance de las tecnologías pueden hacer que lo que no parezca factible en la actualidad, pueda serlo en pocos años.

Las técnicas basadas en el empleo de bacteriófagos y NMR tienen margen de mejora, pero traen también consigo algunas ventajas manifiestas además de la propias de toda técnica laboratorial in vitro, como no requerir de estimulaciones antigénicas y la posibilidad de aplicarse no solo en ganado bovino, sino en multitud de especies animales. Técnicas oficiales como la detección de IFN-γ, que comenzó a desarrollarse en 1990 tuvo una implantación en España que se demoró 16 años, pues se hicieron numerosos estudios para su optimización. Las investigaciones para su continua mejora, el abaratamiento de los costes, la existencia de laboratorios cada vez mejor dotados técnicamente y, por supuesto, la realización de numerosos estudios para determinar su rendimiento son los que permitieron finalmente integrarla en la estrategia diagnóstica actual de los programas de erradicación de TB bovina en muchos países. A pesar de que el diagnóstico es uno de los ámbitos de la TB bovina en los que más se investiga, el contexto epidemiológico y socio-económico en el que se aplica puede cambiar, por lo que es necesario desarrollar y evaluar nuevas técnicas que permitan disponer de herramientas fácilmente adaptables a las nuevas circunstancias que puedan presentarse en el futuro.

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