La edición genética y la manipulación de la actividad meristemática pueden ayudarnos a diseñar cultivos más sostenibles, con características singulares, adecuados a la demanda de los mercados de frutas y hortalizas

Una característica fascinante del crecimiento de las plantas es que éstas son capaces de desarrollar órganos continuamente a lo largo de su vida. Esta capacidad depende de los meristemos, grupos especializados de células madre pluripotentes con capacidad de dividirse y diferenciarse en una amplia variedad de tejidos y órganos vegetales, y que actúan como motores que impulsan el crecimiento continuo de las plantas.

La actividad meristemática depende de mecanismos genéticos y moleculares que empiezan a ser conocidos actualmente. Dichos mecanismos no solo son esenciales para entender el desarrollo de las diferentes estructuras u órganos de la planta, sino que también son especialmente relevantes para la agricultura, puesto que determinan la expresión de rasgos agronómicos como el número de flores y frutos, o el tamaño y la forma de estos últimos (Kitagawa y Jackson, 2019). En conclusión, la actividad de las células meristemáticas decide en gran medida la productividad de los cultivos.

Para ilustrar mejor la relevancia de la función meristemática en la productividad de las especies cultivadas, centrémonos en el tomate (Solanum lycopersicum L.), una hortícola líder a nivel mundial debido a que es un constituyente de la dieta básica de millones de personas por su alto valor nutricional. El avance en el conocimiento del genoma del tomate, y del papel que desempeñan cada uno de sus genes, así como su importancia a nivel fisiológico, han convertido a este en una especie modelo de fruto carnoso, y en la piedra angular de la investigación biológica y la mejora genética de los cultivos de solanáceas (Karlova et al., 2014; Li et al., 2018).

La etapa reproductiva del tomate se inicia cuando el meristemo apical del tallo reprograma su desarrollo y se convierte en un meristemo de inflorescencia. A su vez, éste da lugar a la formación de un meristemo floral y a un nuevo meristemo de inflorescencia (Lozano et al., 2009), tal como se ilustra en la Figura 1. Existe una gran diversidad morfológica en cuanto a la arquitectura de la inflorescencia de tomate. Dependiendo de la variedad, los meristemos de inflorescencia pueden producir sólo una rama con unas pocas flores dispuestas en zig-zag (patrón más común en las variedades comerciales), o varias ramas con decenas de flores. La diferencia entre desarrollar inflorescencias simples no ramificadas, o inflorescencias complejas muy bifurcadas, reside en la velocidad a la que madura el meristemo de inflorescencia, una característica que depende del gen COMPOUND INFLORESCENCE (S). El gen S codifica una proteína que actúa como factor de transcripción específico de plantas, y que pertenece a la familia WOS (WUSCHEL-related homeobox). El papel de la proteína S no es otro que controlar la actividad de otros genes implicados en el mantenimiento de la actividad meristemática. (Lippman et al., 2008).

Investigaciones realizadas por Park y su equipo en 2012 han establecido que la formación de inflorescencias altamente ramificadas en el mutante que ha perdido la función S se debe a un retraso en el proceso de maduración del meristemo de inflorescencia. Esto significa que, en lugar de que cada meristemo de inflorescencia origine un meristemo floral (que finalmente se convierte en una flor) y un nuevo meristemo de inflorescencia para que esta adquiera su estructura final, dicho meristemo genera dos nuevos meristemos de inflorescencia. Este proceso se repite sucesivamente, resultando en la formación de numerosos meristemos de inflorescencia antes de que aparezca el primer meristemo floral. Este fenómeno finalmente conduce al desarrollo de inflorescencias altamente ramificadas con un gran número de flores (Figura 1).

Figura 1. Patrones de ramificación de inflorescencias de plantas silvestres (WT) y del mutante compound inflorescence (s). Figura adaptada de Lippman et al. (2008). Los asteriscos indican el desarrollo asimétrico de las ramas de la inflorescencia (flechas negras en los esquemas). SYM, meristemo simpodial; IM, meristemo de inflorescencia; FM, meristemo floral; L, hoja.

Una característica importante de los meristemos reside en el equilibrio funcional de las células que los integran, de manera que parte de estas mantienen su estado indiferenciado y otras adquieren una nueva identidad, aquella que es propia de los diferentes órganos de la planta. Este balance entre células meristemáticas indiferenciadas y células diferenciadas esta´ regulado de manera precisa a través de un mecanismo de retroalimentación en el que juegan un papel fundamental el factor de transcripción WUSCHEL (WUS), necesario para mantener indiferenciadas las células del meristemo, junto con la vía de señalización extracelular formada por los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y CLV3). De este modo, WUS induce la expresión del péptido señal CLV3, el cual es reconocido por los receptores de membrana CLV1 y CLV2, y juntos activan una cascada de señalización que inhibe la propia expresión de WUS. De este modo, las plantas logran mantener un equilibrio dinámico entre las células madre indiferenciadas y las que se diferencian en diferentes órganos (Somssich et al., 2016).

Las funciones de los genes WUS y CLV están ampliamente conservadas en las angiospermas, tanto en dicotiledóneas como en monocotiledóneas, donde se ha demostrado que la pérdida de función de los genes homólogos de CLV3 produce un incremento del tamaño del fruto. En el caso del tomate, las mutaciones espontáneas locule number (lc) y fasciated (fas), que afectan a la ruta meristemática CLV-WUS, son las principales responsables del aumento del tamaño del fruto que tuvo lugar durante el proceso de domesticación y posterior mejora de este cultivo. lc es una mutación débil de ganancia de función, asociada a dos polimorfismos de nucleótido simple presentes en una región reguladora del gen homólogo a WUS en tomate; mientras que la mutación fas da lugar a una pérdida parcial de la función del homólogo a CLV3, causada por una inversión cromosómica (Xu et al., 2015). Ambas mutaciones actúan de forma sinérgica aumentando el tamaño del meristemo apical, lo que propicia el desarrollo de un meristemo floral más voluminoso, a partir del cual las flores que se forman desarrollan un mayor número de órganos florales, y con ello, frutos multiloculares de gran tamaño (Figura 2A). Algunas de las variedades comerciales de mayor aceptación en el mercado nacional, y en algunos mercados europeos, derivan de variedades tradicionales que portan las mutaciones lc y fas, cuyos frutos son muy acostillados y de gran tamaño (Figura 2B).

Figura 2. Las mutaciones en la ruta meristemática CLAVATA-WUSCHEL, fasciated (fas) y locule number (lc), son las principales responsables del aumento del tamaño del fruto que tuvo lugar durante el proceso de domesticación y mejora del tamaño y forma del tomate (A). Figura adaptada de Rodríguez-Leal et al. (2017). Variedades tradicionales de tomate portadoras de las mutaciones lc y fas, cuyos frutos son de gran tamaño y acostillados (B).

Recientemente, nuestro grupo de investigación ha identificado un nuevo regulador del tamaño y la forma del fruto de tomate. Se trata de EXCESSIVE NUMBER OF FLORAL ORGANS (ENO), cuya mutación conduce al desarrollo de flores con un mayor número de órganos en los verticilos más internos (pétalos, estambres y carpelos). En consecuencia, tras la polinización del ovario, los frutos que cuajan son de mayor tamaño y forma acostillada-plurilocular (Figura 3). El gen ENO codifica un factor de transcripción de la familia APETALA2/Ethylene Responsive Factor (AP2/ERF). La caracterización funcional y molecular de ENO demuestra que éste desempeña su función específicamente en el meristemo floral, reprimiendo a WUS y que, además, es capaz de unirse a una región específica del promotor de este, lo que indica que ENO regula los dominios de expresión de WUS de manera directa, manteniendo así un equilibrio entre las células madre del meristemo floral y las que se diferencian en los distintos órganos de la flor (Yuste-Lisbona et al., 2020).

Junto al papel que tiene ENO en la formación del fruto de tomate, el estudio de la historia evolutiva de los loci ENO, FAS y LC ha revelado que en la especie silvestre S. pimpinellifolium, que es el ancestro inmediato del tomate cultivado, existe un haplotipo (combinación específica de alelos o variantes genéticas que tienden a heredarse como un bloque) del gen ENO asociado al incremento del número de lóculos en el fruto, y que es portador de una deleción en su región promotora. Dicho haplotipo fue seleccionado durante el proceso de domesticación, estableciendo así el fondo genético propicio para aumentar el tamaño de fruto en los cultivares actuales a través de las mutaciones lc y fas, las cuales fueron a su vez seleccionadas durante procesos posteriores dirigidos a la mejora genética del tomate (Yuste-Lisbona et al., 2020).

Figura 3. El mutante excessive number of floral organs (eno) desarrolla flores con un mayor número de pétalos, estambres y carpelos, así como frutos de gran tamaño, multiloculados y acostillados. Figura adaptada de Yuste-Lisbona et al. (2020). Se, sépalos; Pe, pétalos; St, estambres; Ca, Carpelos; WT, silvestre.

Entre las nuevas técnicas genómicas (NGT, por sus siglas en Inglés New Genomic Techniques), la edición genética mediante CRISPR/Cas constituye una tecnología revolucionaria que permite diseñar estrategias de mejora genética basadas en el conocimiento, y cuya trascendencia ha sido reconocida con la concesión del premio Nobel de Química en el 2020 a sus descubridores, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna. Esta tecnología ha sido utilizada por Rodríguez-Leal y colaboradores (2017) para generar alteraciones en el promotor (región reguladora) del gen S como herramienta para modular el “temporizador molecular” o “reloj de maduración” del meristemo de inflorescencia. La manipulación dirigida del promotor del gen S modifica sus niveles de expresión, sin llegar a perder por completo su función, obteniéndose como resultado una variación cuantitativa del número de flores que se desarrollan en una inflorescencia, un carácter de suma importancia para aumentar la productividad del cultivo. Por tanto, este estudio demuestra que la edición genética de promotores ofrece la posibilidad de generar nueva variación fenotípica en caracteres cuantitativos como la arquitectura de la inflorescencia, brindando así una amplia gama de posibilidades en la mejora de cultivos.

Mediante CRISPR/Cas hemos podido editar los promotores de los genes que regulan el tamaño del meristemo floral de tomate (ENO, FAS y LC), lo que ha tenido como resultado la obtención de una amplia gama de tamaños de frutos, ofreciendo de este modo un enorme potencial para desarrollar nuevas variedades más productivas y adecuadas para diferentes mercados de hortalizas frescas. A pesar de que las NGT nos permiten mejorar los cultivos con mayor precisión y de forma más eficiente, estas técnicas no están siendo actualmente utilizadas en la Unión Europea porque las variedades obtenidas mediante CRISPR/Cas se siguen considerando como cultivos transgénicos. Sin embargo, esta dinámica parece estar cambiando, puesto que la Comisión Europea publicó el pasado 5 de julio de 2023 una propuesta destinada a modificar la regulación de las plantas obtenidas a través de la edición genética, utilizando métodos NGT como las herramientas CRISPR/Cas. Dicha propuesta incluye que las plantas desarrolladas a través de NGT, que podrían haberse obtenido del mismo modo de manera natural o a través de cruzamientos tradicionales, no estarán sujetas a la Directiva 2001/18 sobre organismos modificados genéticamente, una modificación tremendamente esperada por las empresas biotecnológicas del sector agrícola. Los principales elementos de la propuesta regulatoria sobre plantas obtenidas por NGT se pueden consultar en la web del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación

(https://www.mapa.gob.es/es/agricultura/temas/biotecnologia/2023_08_30_principaleselementospropuestangt_tcm30-660388.pdf)

Mediante CRISPR/Cas hemos podido editar los promotores de los genes que regulan el tamaño del meristemo floral de tomate (ENO, FAS y LC), lo que ha tenido como resultado la obtención de una amplia gama de frutos, de tamaños y formas diferentes, idóneos para el desarrollo de nuevas variedades más productivas y mejor adaptadas a los distintos mercados de hortalizas frescas

A medida que continuamos investigando y comprendiendo mejor la regulación genética de la actividad meristemática, estamos en una posición privilegiada para impulsar estrategias de mejora genética basadas en el conocimiento y dirigidas a optimizar e incrementar la productividad de los cultivos en distintas zonas productoras, e incluso ofrecer alternativas a los desafíos que supone el cambio climático. Este nuevo marco normativo propuesto por la Comisión Europea permitiría el uso de las NTG en la obtención de variedades vegetales, lo que reduciría el tiempo y los costos en comparación con los métodos convencionales. En este contexto, la edición genética y la manipulación de la actividad meristemática pueden ayudarnos a diseñar cultivos con mayor rendimiento y capaces de producir frutos con características singulares según la demanda de los mercados, a través del uso de herramientas innovadoras que contribuyen a aumentar la sostenibilidad y la resiliencia de nuestro sistema alimentario, facilitando alcanzar los objetivos planteados en el Pacto Verde Europeo y la Estrategia 'De la Granja a la Mesa'.

Agradecimientos

Esta investigación ha sido financiada por los proyectos de investigación BREMAS-Tom (Ref. PID2019-110833RB-C31, MCIN/AEI/10.13039/501100011033; Ministerio de Ciencia e Innovación) y MERITOM (Ref. P20_00324, Junta de Andalucía/UE-FEDER). Los autores agradecen al Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario - CeiA3 el apoyo en actividades de I+D.

Referencias

Karlova R, Chapman N, David K, Angenent GC, Seymour GB, de Maagd RA (2014). Transcriptional control of fleshy fruit development and ripening. Journal of Experimental Botany 65: 4527-4541.

Kitagawa M, Jackson D (2019). Control of meristem size. Annual Review of Plant Biology 70: 269-291.

Li Y, Wang H, Zhang Y, Martin C (2018). Can the world's favorite fruit, tomato, provide an effective biosynthetic chassis for high-value metabolites? Plant Cell Reports 37: 1443-1450.

Lippman ZB, Cohen O, Alvarez JP, Abu-Abied M, Pekker I, Paran I, Eshed Y, Zamir D (2008). The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biology 6: e288.

Lozano R, Giménez E, Cara B, Capel J, Angosto T (2009). Genetic analysis of reproductive development in tomato. The International Journal of Developmental Biology 53: 1635-1648.

Park SJ, Jiang K, Schatz MC, Lippman ZB (2012). Rate of meristem maturation determines inflorescence architecture in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: 639-644.

Rodríguez-Leal D, Lemmon ZH, Man J, Bartlett ME, Lippman ZB (2017). Engineering quantitative trait variation for crop improvement by genome editing. Cell 171: 470-480.e8.

Somssich M, Je BI, Simon R, Jackson D (2016). CLAVATA-WUSCHEL signaling in the shoot meristem. Development 143: 3238-3248.

Xu C, Liberatore KL, MacAlister CA, Huang Z, Chu YH, Jiang K, Brooks C, Ogawa-Ohnishi M, Xiong G, Pauly M, Van Eck J, Matsubayashi Y, van der Knaap E, Lippman ZB (2015). A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics 47: 784-792.

Yuste-Lisbona FJ, Fernández-Lozano A, Pineda B, Bretones S, Ortíz-Atienza A, García-Sogo B, Müller NA, Angosto T, Capel J, Moreno V, Jiménez-Gómez JM, Lozano R (2020). ENO regulates tomato fruit size through the floral meristem development network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 117: 8187-8195.