Empleo de biopesticidas para el control de la enfermedad del moho gris (Botrytis cinerea)

Hongos como Thichoderma harzianum han demostrado un control eficaz de Botrytis en plantas de judías. En la imagen un cultivo de judías.

Con respecto a las pérdidas ocasionadas por el desarrollo de enfermedades microbianas, el 14% de las pérdidas en la agricultura son derivadas por el desarrollo de agentes patógenos y, de estas, el 42% están causadas por agentes fúngicos. De hecho, los hongos son reconocidos como una de las principales amenazas hacia los sistemas agrónomos, debido principalmente a su increíblemente alta tasa de reproducción, la cual permite que se expandan a altas velocidades y alcancen a innumerables individuos en un corto periodo de tiempo.

Entre los hongos fitopatógenos destaca Botrytis cinerea, conocido por ser el causante de la enfermedad denominada podredumbre gris, una afección que se desarrolla en un amplio rango de especies vegetales, más de 1.400, especialmente en periodos o zonas de humedad. El principal síntoma es la aparición de manchas grisáceas con textura aterciopelada en cualquiera de las partes aéreas de la planta, es decir, hojas, flores, frutos y tallos (Fig. 1). Cuando la enfermedad se desarrolla los frutos comienzan a cubrirse con los filamentos del hongo y a pudrirse, esto es debido a la naturaleza necrotrófica de Botrytis, que se alimenta del tejido muerto de la planta. Este hongo ha sido descrito como una de las principales causas de pérdidas agrícolas en el periodo de almacenamiento y postcosecha.

Figura 1. Botrytis cinerea infectando una hoja de tomate.

Tradicionalmente, para la prevención y control de esta enfermedad se han utilizado fungicidas de síntesis química, desgraciadamente, el uso indiscriminado de estos ha traído una serie de consecuencias negativas, por lo que su uso está cada vez más restringido. Además, el sentimiento de la población hacia el empleo abusivo de pesticidas químicos en la agricultura es cada vez más negativa. Este rechazo está basado principalmente en el daño medioambiental causado, derivado de que los pesticidas se acumulan en los suelos en forma de residuos tóxicos que pueden llegar a las aguas subterráneas y contaminar los acuíferos. En suma, el abuso de estos productos en los últimos años ha provocado el desarrollo de resistencias por parte de los fitopatógenos, provocando que la eficacia de los pesticidas se reduzca, siendo necesario el incremento en el número de aplicaciones y la utilización de nuevos fungicidas. En este sentido, Botrytis cinerea es especialmente peligroso ya que posee un ciclo de vida muy corto, lo cual le permite desarrollar resistencias mucho más rápido que otros patógenos.

Debido a esto, en los últimos años está siendo necesario desarrollar alternativas más sostenibles para combatir las diferentes plagas vegetales y una de las principales estrategias está basada en los llamados biofungicidas microbianos. Los biofungicidas son fungicidas diseñados a partir de microorganismos inocuos y beneficiosos que se encuentran de manera natural en el ecosistema de las plantas. Estos productos presentan una serie de ventajas frente a los pesticidas tradicionales como que son mucho más selectivos y los costes de fabricación son menores. Además, no producen residuos tóxicos, disminuyen los efectos negativos de los patógenos y aportan beneficios a las plantas. Como los microorganismos beneficiosos poseen diferentes mecanismos de acción a la hora de controlar las infecciones, reducen la tasa de aparición de resistencias, lo cual, como ya se ha mencionado, es un factor clave a la hora de controlar a Botrytis (Fig. 2).

No obstante, también existen inconvenientes. Uno de los principales es la influencia de las condiciones climáticas. Por ello, a menudo, la estrategia elegida es una combinación de ambos tipos de pesticidas, químicos y biológicos.

El hongo Botrytis cinerea es difícil de controlar debido a la variedad de modos de ataque que presenta, a la capacidad de infectar diversos huéspedes y a la habilidad de sobrevivir durante largos periodos de tiempo en condiciones desfavorables. Por eso, es poco probable lograr un control total del hongo usando únicamente un único método de control. Es habitual emplear de uno a veinte métodos diferentes durante una única temporada. Por lo tanto, es importante conocer los diferentes mecanismos por los que los microorganismos interaccionan con el hongo, lo cual permitirá desarrollar productos biopesticidas de forma apropiada.

A continuación, se mencionan algunos de los mecanismos de acción más estudiados a la hora de controlar a Botrytis cinerea. Estos son la producción de moléculas difusibles, de compuestos volátiles, la producción de enzimas líticas, la competición y la inducción de la resistencia sistémica de la planta.

En primer lugar, la producción de moléculas difusibles es un mecanismo que deriva del metabolismo secundario de los microorganismos, el cual produce moléculas que difunden a través del medio y llegan a los patógenos, sobre los que actúan reduciendo o incluso inhibiendo su crecimiento. Estas moléculas pueden ser sustancias antimicrobianas o sideróforos.

Por un lado, las sustancias antimicrobianas son compuestos microbianos que, a bajas concentraciones, son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Este es un grupo de moléculas de bajo peso molecular y químicamente heterogéneas que inducen un efecto adverso en el metabolismo de otros microorganismos. Por otro lado, los sideróforos son también moléculas difusibles de bajo peso molecular, que están relacionadas con el metabolismo del hierro. El hierro es un micronutriente esencial presente en los suelos. Sin embargo, en condiciones normales su solubilidad es extremadamente baja, lo que dificulta su adquisición por parte de los seres vivos. En este sentido, la disponibilidad del hierro se ha convertido en un factor limitante por el que los organismos han de competir. Los microorganismos solucionan este problema mediante la producción de sideróforos, una molécula con gran afinidad por el hierro. Estas moléculas han sido ampliamente estudiadas en diferentes campos como la medicina y, dentro de la agricultura, no sólo juegan un papel en el biocontrol, sino que también son importantes porque mejoran la fertilidad de los suelos. Botrytis cinerea necesita el hierro para su desarrollo, la germinación de las esporas y el crecimiento del micelio. En condiciones de baja disponibilidad del hierro, los sideróforos pueden actuar secuestrando el poco que exista y limitando así el crecimiento de este fitopatógeno. En este sentido, algunas bacterias pertenecientes a los géneros Bacillus y Pseudomonas destacan en la producción de metabolitos secundarios. Algunas especies ya han sido estudiadas y sus efectos en planta han sido positivos. Por ejemplo, cepas seleccionadas de Bacillus producen lipoproteínas que han logrado una inhibición del 100% del hongo en plantas de vid, del 12% en plantas de fresa y del 50% en plantas de tomate. Con respecto a los sideróforos, especies como Pseudomonas fluorescens, que produce pioverdina, un sideróforo característico de este género, es capaz de suprimir el crecimiento de Botrytis cinerea.

En contraposición a las moléculas difusibles, están las moléculas volátiles, que son compuestos pequeños con bajo peso molecular, alta presión de vapor y bajo punto de ebullición. Aquí se engloban moléculas como los terpenos y los alcoholes. Son considerados un buen mecanismo de control ya que son capaces de viajar largas distancias e interactuar con otros microorganismos. Además, poseen una serie de ventajas sobre otros mecanismos, como que son efectivas a bajas concentraciones, difunden a través de los poros del suelo y pueden actuar sobre los patógenos sin establecer contacto. También, pueden promover el crecimiento vegetal, potenciar la tolerancia a estreses abióticos e inducir la resistencia sistémica de la planta. Algunos ejemplos que ya han sido estudiados son cepas seleccionadas de Bacillus amyloliquefaciens productoras de moléculas como el ácido ftalico, una sustancia volátil que suprime el crecimiento del micelio fúngico en un 46%.

Otro mecanismo importante es la producción de enzimas líticas, que son aquellas capaces de romper compuestos poliméricos como la quitina, proteínas, celulosa o incluso ADN, interfiriendo con la actividad metabólica de los patógenos, inhibiendo la germinación de los conidios y lisando los tubos germinativos. En este sentido, las enzimas líticas son especialmente interesantes a la hora de degradar la pared celular de los hongos. Aunque no todos los hongos tienen la misma composición en su pared celular, sí se puede hablar de que la mayoría poseen una estructura común. Esta se caracteriza por ordenarse en capas, donde la capa más interna está más conservada en las diferentes especies fúngicas, mientras que las capas más externas son más heterogéneas. Normalmente, la capa interna está unida de forma covalente por enlaces de β-[1,3] glucano y quitina, y es la capa responsable de mantener la configuración de la célula. Con respecto a Botrytis cinerea, los análisis de la pared han desvelado que está configurada por azúcares neutrales – principalmente glucosa, arabinosa, galactosa, xilosa y manosa –, proteínas, quitina y ácidos urónicos. Esto concuerda con que muchos microorganismos conocidos por ser capaces de degradar estos compuestos son capaces de controlar el crecimiento de este hongo. Sin embargo, la composición mayoritaria de la pared suele ser un 20% de quitina, entre un 50 y un 60% de glucanos y entre un 20 y un 30% de proteínas, por lo tanto, la búsqueda de microorganismos con capacidad de degradar alguno de estos compuestos resulta altamente interesante para el desarrollo de nuevos biopesticidas. En este grupo destacan algunos hongos como principales productores. Hongos como Thichoderma harzianum han demostrado un control eficaz de Botrytis en plantas de judías mediante la producción de diversas enzimas líticas como proteasas, quitinasas y β-1,3-glucanasas.

Los mecanismos hasta ahora descritos son los que tienen una acción directa sobre el hongo, sin embargo, hay otros mecanismos de acción que, si bien no actúan directamente sobre el patógeno, sí tienen un efecto indirecto en el desarrollo de la enfermedad. Estos son principalmente dos, la competición y la inducción de la resistencia sistémica en la planta.

La competición consiste en limitar los recursos de espacio y nutrientes para que el Botrytis cinerea o el patógeno en cuestión no sea capaz de desarrollarse correctamente. Botrytis cinerea es un patógeno necrotrófico, lo que significa que se alimenta de las células muerta que él mismo ha eliminado previamente. Por lo tanto, antes de penetrar en las células vegetales, este tipo de hongo necesita obtener nutrientes exógenos para la germinación y el crecimiento en la superficie de las plantas. El mecanismo de acción por competición consiste en que otros microorganismos inocuos colonicen las superficies de las plantas, limitando la disponibilidad de espacio y de nutrientes, lo que resulta en una reducción en la tasa de germinación de las esporas fúngicas y, por lo tanto, en la capacidad invasiva del patógeno. Adicionalmente, la reducción de la disponibilidad de nutrientes también influye en la capacidad del hongo de completar la infección, ya que también impide la correcta formación del tubo germinativo. En conclusión, la competición parece ser un método efectivo contra Botrytis cinerea. En este método de control destacan las levaduras, así, especies como Wickerhamomyces anomalushan demostrado que compiten con Botrytis cinerea por el espacio y los nutrientes en plantas de tomate 'Cherry'.

El otro método indirecto es inducción de la resistencia sistémica de la planta, esto es, la activación de su sistema de respuesta a agresiones externas, el cual puede ser activado tanto por agentes bióticos como abióticos. De hecho, el mismo patógeno es un factor de activación de la resistencia sistémica, ya que, por ejemplo, Botrytis cinerea produce las enzimas poligalacturonasas que hidrolizan los componentes de la pared vegetal, liberando oligogalacturonides, los cuales son inductores de la respuesta de defensa de la planta. Del mismo modo, hay microorganismos no patógenos que son capaces de activar estas defensas. La resistencia inducida se puede dividir en dos grupos, la resistencia sistémica adquirida (SAR) y la resistencia sistémica inducible (ISR). La primera es la inmunidad inherente de la planta que es activada tanto por factores abióticos como bióticos, y tanto por patógenos como no patógenos. Además, se han estudiado que el ácido salicílico está muy relacionado con la activación de este tipo de respuesta, ya que es un compuesto químico característico de las infecciones. El segundo consiste en una respuesta hipersensible a microrganismos PGP y en este caso son el etileno y el ácido jasmónico, dos fitohormonas, las moléculas que juegan un papel principal. Algún ejemplo estudiado frente a Botrytis cinerea son Bacillus velezensis en Arabidopsis thaliana, que produce ácido acelaico, que induce la resistencia sistémica inducible o Pseudomonas aeruginosa en plantas de judías, que producen ácido salicílico, induciendo la resistencia sistémica adquirida.

A la hora de desarrollar biopesticidas, hay una serie de microorganismos que destacan por su habilidad de controlar eficazmente a Botrytis cinerea:

• Dentro de las bacterias destacan por sus capacidades antifúngicas los géneros Bacillus, Paenibacillus y Pseudomonas. El género Bacillus se caracteriza por producir una gran cantidad de sustancias antibióticas, como la bacteriocina o los péptidos antibióticos. Las especies de este género son consideradas biológicamente inocuas y además poseen una serie de características ventajosas que les permite sobrevivir con mayor facilidad. Por ejemplo, son capaces de formar esporas cuando las condiciones climáticas no son favorables, lo que es ventajoso a la hora de producir y almacenar el biopesticida, ya que no perderá sus propiedades. Paenibacillus y Pseudomonas también son conocidos por producir una gran cantidad de metabolitos secundarios con capacidad antifúngica como las sustancias antibióticas o las enzimas líticas.
• Con respecto a los hongos filamentosos, poseen una serie de características biológicas que les confieren una serie de ventajas, como una alta tasa de reproducción, un ciclo de vida es corto y que son específicos a la hora de llevar a cabo su actividad antifúngica. Uno de los más estudiados es el género Trichoderma debido a sus múltiples mecanismos de acción como inducción de resistencia en la planta, micoparasistismo, antibiosis y competición por espacio y nutrientes. De hecho, Trichoderma harzianum fue el primer agente de biocontrol frente a enfermedades vegetales aceptado por la EPA (del inglés, Environmental Protection Agency) de Estados Unidos. Además, hay estudios sobre otros hongos filamentosos como Gliocladium, el cual puede atacar directamente al hongo mediante perforaciones en las células de la pared del hongo. Paralelamente, los hongos filamentosos producen metabolitos secundarios con interés industrial como la producción de biofuel.
• Por último, las levaduras son también muy estudiadas como agentes de biocontrol, sobre todo en las frutas. Estas presentan una serie de ventajas con respecto a las bacterias como que tienen menos requerimientos nutricionales, su habilidad de colonizar superficies por largos periodos de tiempo y su rápido crecimiento. Al igual que los hongos filamentosos, poseen una gran variedad de modos de acción frente a los patógenos como la competición por nutrientes y espacio, la producción de toxinas, la secreción de enzimas, la producción de compuestos orgánicos volátiles (VOCs), parasitismo y la inducción de resistencia sistémica. Algunas especies que ya están siendo usadas son Candida oleophila en manzanas y Pichia guilliermondii en tomate.

Conclusiones

Los hongos como Botrytis cinerea son una de las principales amenazas para la agricultura, siendo responsables del 40% de las pérdidas en los cultivos y de pérdidas económicas de entre 10 y 100 billones de dólares estadounidenses. Hasta ahora los pesticidas químicos han sido la solución más eficiente, sin embargo, han traído una serie de consecuencias negativas que han hecho palpable la necesidad de buscar soluciones alternativas más sostenibles. Así, han surgido los biopesticidas como una solución innovadora. Su potencial radica en los llamados microorganismos PGP, los cuales poseen una serie de mecanismos de promoción del crecimiento vegetal y, además, mecanismos de biocontrol de patógenos.

La gran diversidad de microorganismos y de metabolismos microbianos ha revelado una gran variedad de mecanismos de acción con potencial antifúngico. Algunos de los más estudiados, como se ha mencionado previamente, son la producción de moléculas difusibles, tanto de carácter antimicrobiano como sideróforos, la producción de moléculas volátiles, de enzimas líticas y algunos mecanismos indirectos como la competición por espacio y nutrientes y la inducción de la resistencia sistémica de la planta. Esta gran diversidad es una potente herramienta contra Botrytis cinerea, ya que permite atacar diferentes partes del hongo, así como actuar en las diferentes etapas de su ciclo de vida, aumentando su eficacia.

Agradecimientos

Proyecto RETOS 2017 BOTRYBIOC -RTC-2017-6007-2 (Ministerio de Ciencia e Innovación). Excellence Unit of the Spanish-Portuguese Institute for Agricultural Research (CIALE) (CLU-2018-04). Ayuda postdoctoral Marie Sklodowska-Curie No 101003373.

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