El color de la carne es otro criterio utilizado en la evaluación y selección de descendientes para la obtención de nuevas variedades

En este artículo se resume el trabajo realizado por el grupo de genómica del CRAG e IRTA donde identifican el gen que determina el color de la piel del ciruelo japonés y obtienen un marcador molecular capaz predecir de qué color serán los frutos. Se discute la relevancia de los resultados y su aplicación en programas de mejora.

Producción de ciruelo japonés y obtención de nuevas variedades

En España se dedican alrededor de 14.800 ha al cultivo del ciruelo, con una producción de anual de alrededor de 179.000 toneladas (FAOSTAT, 2019). Las comunidades con mayor producción son Extremadura, seguida de Andalucía, región de Murcia, Comunidad Valenciana y Aragón (MAPA, 2021).

El ciruelo japonés es una de las dos especies principales de ciruelo comercializadas. Las variedades de esta especie están adaptadas a climas templados y subtropicales y se utilizan principalmente para el mercado en fresco. La otra especie es el ciruelo europeo, que está más adaptada a climas frescos y templados y sus frutos se consumen secos o en mermeladas.

El ciruelo japonés se deriva principalmente de la especie silvestre Prunus salicina, la cual se ha ido cruzando con diferentes especies de Prunus para producir las variedades que ahora encontramos en el mercado. Estos cruzamientos interespecíficos, juntamente con la autoincompatibilidad natural de la especie, han proporcionado al cultivo gran diversidad varietal, especialmente en lo que respecta al color del fruto.

Desde 1957 se ha solicitado el registro y/o la inclusión en listas nacionales de más de 865 nuevas variedades de ciruelo japonés en todo el mundo, de las cuales el 77% han sido aprobadas o están en proceso de evaluación. En la actualidad 479 de éstas están sujetas a protección, 275 de ellas en Europa y concretamente 30 en España (CPVO, 2021).

En general, los principales objetivos de los programas de mejora de ciruelo japonés son maduración temprana, bajas necesidades de frío, resistencia a enfermedades y calidad de fruto. La apariencia del fruto, incluyendo el color de piel y carne, son determinantes en el proceso de selección.

Las antocianinas y el color de los órganos

El color y tonalidad que va desde rojo a morado de la piel de las ciruelas se debe a la presencia y acumulación de un pigmento antioxidante de la familia de los flavonoides llamado antocianina. La ausencia de este pigmento se traduce en frutos de piel amarilla o verde. Estos pigmentos no se encuentran solamente en los frutos, sino que también se acumulan en diferentes órganos de muchas especies del reino vegetal, donde realizan diversas funciones. Por ejemplo, en flores fomentan la polinización, mientras que en frutos su dispersión. En hojas y tejidos vegetales en general, tienen un efecto foto-protector y participan en la recuperación frente diferentes lesiones (Winkel-Shirley, 2002; Gould, 2004).

Se ha demostrado que, debido a su capacidad antioxidante, las antocianinas no sólo tienen efectos beneficiosos en las plantas, sino que cuando se incorporan a la dieta humana aportan cualidades saludables. Entre esas cualidades se encuentra su actividad anti-inflamatoria y la prevención de enfermedades cardiovasculares, obesidad y diabetes (Khoo y col., 2017).

En algunos frutos los consumidores asocian el color rojo con madurez, mejor sabor y aroma. Así pues, el color del fruto tiene un impacto importante en el consumidor, que además de buscar fruta de buena calidad gustativa y con buena apariencia, cada vez más opta por alimentos de alta calidad nutricional. Por lo tanto, hay un interés considerable en obtener nuevas variedades con diversidad en color, tonalidad y patrones de coloración a la vez que con mayor calidad nutricional. Este interés se ha visto acompañado por un interés científico creciente por entender el mecanismo de regulación de la síntesis y acumulación de las antocianinas (García-Gómez y col., 2021).

¿Cómo se regula la síntesis de antocianinas?

Se sabe que la síntesis de este compuesto en especies de la familia de las rosáceas, a las que pertenece el ciruelo juntamente con la fresa, melocotón, cereza, albaricoque, manzana o pera (entre otros frutales), está regulada por genes de la familia MYB10, y que cambios en algunos de estos genes son responsables de cambios en el color del fruto. Sin embargo, los genes MYB10 no son los que sintetizan estos pigmentos, aunque sí intervienen en el proceso. Para ello, las proteínas producidas por genes MYB10 se unen a las producidas por otros dos genes (bHLH y WDR), formando un complejo que activará el funcionamiento de otros genes implicados en la síntesis del pigmento (Gonzalez y col., 2008).

Además de regularse por los propios procesos metabólicos del órgano (como la maduración), los genes MYB10 también pueden activarse por señales externas como la luz, el frío o la temperatura en general. Eso explica que algunas variedades adquieran más o menos color en diferentes condiciones climáticas, en función de su exposición a la luz o tras conservarse en cámaras frigoríficas.

¿Qué se sabe de la síntesis de antocianinas en el ciruelo japonés?

Las variedades de ciruelo presentan gran variabilidad en el color del fruto, tanto en la piel como en la carne (Figura 1). Incluso, si se cruzan con otras especies como el albaricoquero, también pueden presentar diferentes niveles en el grado de cobertura del color de la piel, como es el caso de las variedades de piel moteada. Este patrón moteado en la piel se debe a que áreas pequeñas de piel son transparentes y dejan ver el color rojo de la carne, mientras que el resto de la piel es opaca sin antocianinas, es decir amarilla o verde. Por lo tanto, esta diversidad y complejidad hace del ciruelo un gran modelo para estudiar qué genes son responsables de la variabilidad en el color de los frutos.

En un estudio que hemos publicado recientemente en la revista científica Frontiers in Plant Science (Fiol y col. 2021) hemos encontrado que una o varias copias de este gen también determinan el color en la piel del ciruelo. Esta investigación es relevante desde el punto de vista científico, ya que ayuda a entender la regulación de la síntesis de antocianinas en ciruelo, pero sobretodo aporta una herramienta excepcional para la mejora de este frutal, ya que se ha podido desarrollar un marcador de PCR sencillo y económico mediante el cual, en una única reacción utilizando ADN de las hojas, se puede determinar el color del fruto. Este marcador se puede utilizar para analizar los descendientes de un cruzamiento, de forma que pocas semanas después de su germinación, y por lo tanto tres o cuatro años antes de observarse el primer fruto en el árbol, podemos saber de qué color será el fruto que proporcionará.

El genoma del ciruelo japonés

El ciruelo japonés es una especie diploide obtenida tras varios cruzamientos de Prunus salicina con otras especies del género Prunus. Pese a su importancia comercial y aunque se han secuenciado un par de variedades asiáticas, todavía no se dispone de un genoma de referencia de calidad para las variedades europeas, es decir, todavía no sabemos su secuencia de ADN completa ni cómo sus genes se localizan a lo largo del genoma. Sin embargo, mediante estudios genéticos se ha determinado que el genoma del ciruelo es muy similar al del melocotonero (Prunus persica) -que sí está secuenciado- y que sus genes se ordenan de forma similar. Esta homología también se conserva con otras especies del género Prunus como el albaricoquero (P. armeniaca), el cerezo (P. avium) o el almendro (P. dulcis), cuyos genomas también están secuenciados (Mnejja et al. 2004, 2005). Por lo tanto, pese a no disponer todavía de un buen genoma de referencia en ciruelo, podemos utilizar como referencia el genoma de estos otros frutales cercanos.

Figura 2. A (izquierda) combinaciones de alelos encontradas en las familias segregantes. Las combinaciones 1 y 3 producen frutos con coloración antociánica en dominancia, mientras que los alelos 2, 4, 5 y 6 son recesivos y producen frutos de color amarillo o verde. B (derecha) ejemplo de segregación esperada tras cruzar dos parentales rojos, cada uno portador de un alelo dominante que produce frutos rojos y de otro recesivo que produce frutos amarillos. Únicamente cuando se combinen los dos alelos recesivos se observarán frutos amarillos

El material utilizado

En este estudio analizamos ADN de 31 variedades comerciales, de 81 líneas avanzadas del programa de mejora de la empresa PLANASA y de 382 descendientes de 6 cruzamientos realizados y evaluados por los mejoradores de esta empresa obtentora de nuevas variedades de ciruelo en España. El color del fruto se clasificó de forma binaria, es decir en el análisis estadístico incluimos en un único grupo las que tenían color antociánico y en otro grupo las que no. Los individuos con fenotipo moteado, se clasificaron como individuos sin color, ya que el moteado rojo se debe a la visualización de la pulpa a través de la piel transparente.

El método utilizado

Para realizar este estudio nos basamos en la proximidad genética del ciruelo con otras especies del género Prunus para las que sí hay un genoma de referencia, y también en la proximidad con otras especies cercanas de la familia de las rosáceas (como manzana y fresa) en las que se había estudiado esta característica y determinado el papel de los genes MYB10 en la coloración del fruto.

El método utilizado consistió en buscar dónde estaban los genes MYB10 asociados con la coloración del fruto en los genomas de Prunus disponibles, que resultaron estar agrupados en el cromosoma 3, y leer su secuencia. Una característica de estos genes es que se encuentran muy conservados entre especies, es decir, dos especies diferentes como el melocotonero y el ciruelo tienen genes MYB10 muy similares. Por lo tanto, una vez hallados los genes MYB10 en melocotonero diseñamos cebadores que, combinados con otros métodos biotecnológicos y de análisis bioinformáticos, nos permitieron identificar y caracterizar por completo diferentes copias de genes MYB10 en Prunus salicina (PsMYB10).

Gracias al estudio de las 6 familias segregantes, previamente fenotipadas, pudimos ver cómo se heredaban las diferentes copias del gen y cuáles lo hacían conjuntamente con el color del fruto. En total observamos 6 combinaciones de alelos diferentes, estando dos de ellas asociados con la coloración (Figura 2). Esto permitió hipotetizar sobre el gen (y su alelo) causante de la coloración de la piel fruto. En concreto, el gen candidato es una de las copias del gen PsMYB10.1. El alelo asociado con la coloración y falta de coloración se validó en las 31 variedades comerciales y en las 81 líneas avanzadas del programa de mejora.

Para aportar más evidencias sobre la implicación de este gen en el color de la piel, estudiamos si éste se expresa (si es funcional) o no en la piel. En este análisis vimos que, en los frutos amarillos, verdes o moteados, el gen no se expresa mientras que sí lo hace en los frutos con color (Figura 3).

El análisis de la secuencia del gen PsMYB10.1 nos ha permitido identificar cambios genéticos (mutaciones) que podrían ser las causas de la variación en la coloración. Uno de esos cambios consiste en la mutación en una región del gen PsMYB10.1 donde se une otro gen (HY5) inducido por la luz. La falta de esta región en el alelo causante de la falta de coloración podría ser la causa de la pérdida de función del PsMYB10.1 al no poder unírsele la proteína del gen HY5 para activarlo (Figura 4); este mecanismo se ha descrito en manzana (An et al. 2017). Sin embargo, otras de las mutaciones observadas también son compatibles con la variación en este fenotipo.

Conclusiones

Aunque hemos identificado el gen causante de la coloración de la piel del fruto en ciruelo japonés, el mecanismo por el cual se sintetizan y acumulan las antocianinas todavía no está totalmente resuelto. En este estudio hemos aportado información muy relevante para poder esclarecerlo en futuros experimentos.

El marcador se ha validado en líneas avanzadas y en variedades comerciales y puede utilizarse ya de forma rutinaria para determinar la combinación alélica en los parentales de un programa de mejora y, por lo tanto, saber qué segregación podemos esperar al intercruzarlos. Otra aplicación altamente relevante es la evaluación de los descendientes de los cruzamientos en estadio de seedling, para tomar decisiones en el programa. Por ejemplo, podría utilizarse para seleccionar o descartar aquellos con un fenotipo no deseado. Otra aplicación sería la plantación de los descendientes en parcelas según su el color del fruto, lo que facilitaría la comparación entre frutos de la misma tipología.

El color de la carne es otro criterio utilizado en la evaluación y selección de descendientes para la obtención de nuevas variedades. En este artículo presentamos únicamente un gen y un marcador para el color de la piel, pero actualmente estamos trabajando en la identificación del gen o genes para el color de la carne. Los resultados que hemos obtenidos son muy esperanzadores y esperamos poder concluir el trabajo en los próximos meses. Todo esto proporcionará una herramienta fundamental para seleccionar de forma temprana el color de los frutos del ciruelo, tanto de piel como de pulpa.

Referencias

• An, J.P., Qu, F.J., Yao, J.F., Wang, X.N., You, C.X., Wang, X.F., et al. (2017). The bZIP transcription factor MdHY5 regulates anthocyanin accumulation and nitrate assimilation in apple. Hort.. Res. 4(1), 1-9.
• CPVO, 2021. https://vf.plantvarieties.eu/varieties. Acceso, 20/8/2021.
• FAOSTAT 2019. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Data Crops.
• Fiol, A., García-Gómez, B.E., Jurado-Ruiz, F., Alexiou, K., Howad, W., Aranzana, M.J. (2021). Characterization of Japanese Plum (Prunus salicina) PsMYB10 alleles reveals structural variation and polymorphisms correlating with fruit skin color. Front. Plant Sci..
• García-Gómez, B., Salazar, J., Nicolás-Almansa, M., Razi, M., Rubio, M., Ruiz, D., et al. (2021). Molecular bases of fruit quality in Prunus species: an integrated genomic, transcriptomic, and metabolic review with a breeding perspective. Int. J. Mol. Sci. 22, 333.
• Gonzalez, A., Zhao, M., Leavitt, J. M., and Lloyd, A. M. (2008). Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex in Arabidopsis seedlings. Plant J. 53, 814–827.
• Gould, K. S. (2004). Nature's Swiss Army Knife: the diverse protective roles of anthocyanins in leaves. J. Biomed. Biotechnol. 2004, 314–320.
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• MAPA, 2021.. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Anuario de estadística agraria.
• Mnejja, M., Garcia-Mas, J., Howad, W., Badenes, M. L., and Arús, P. (2004). Simple-sequence repeat (SSR) markers of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) are highly polymorphic and transferable to peach and almond. Mol. Ecol. Notes 4, 163–166.
• Mnejja, M., Garcia-Mas, J., Howad, W., Arús, P. (2005), Development and transportability across Prunus species of 42 polymorphic almond microsatellites. Mol. Eco. Notes 5: 531-535.
• Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Curr. Opin. Plant Biol. 5, 218–223.