Los resultados de este trabajo exponen por primera vez la regulación transcripcional de los componentes del signalosoma de ABA en frutos sometidos a condiciones de estrés hídrico

Regulación del sistema de percepción del ácido abscísico (ABA) durante la deshidratación poscosecha de los frutos cítricos

P. Romero; M.J. Rodrigo; y M.T. Lafuente (Dpto. de Ciencia de los Alimentos. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos-CSIC)08/01/2013

El estrés hídrico es un factor importante en la calidad poscosecha de los frutos. Puesto que el ácido abscísico (ABA) es un regulador clave en la respuesta a la deshidratación, entender cómo se percibe esta hormona puede ayudar a identificar genes diana para mejorar la resistencia a la deshidratación en cultivos hortícolas. Para estudiar la implicación del sistema de percepción del ABA en la respuesta a la deshidratación de los frutos cítricos, hemos realizado un análisis transcripcional comparativo de los componentes del signalosoma de ABA (CsPYR/PYL/RCAR-PP2CA-SnRK2) entre frutos estresados de la naranja ‘Navelate’ (Citrus sinensis L. Osbeck) y su mutante específico de fruto y deficiente en ABA, denonimado ‘Pinalate’, que es más propenso a la deshidratación.

Sin embargo, la expresión de los reguladores negativos de la ruta de señalización (CsPP2CAs) fue altamente regulada por el contenido en ABA y significativamente diferente en ambos cultivares. Estos datos sugieren que estos genes juegan un papel importante en la regulación de la respuesta al ABA en los frutos cítricos sometidos a estrés hídrico. Los resultados obtenidos tras la aplicación exógena de ABA indican que, aunque el mutante puede percibir el ABA, la señal hormonal puede verse alterada por los reducidos niveles de CsPP2CAs. Los resultados globales indican la importancia de estos reguladores negativos como dianas para mejorar la resistencia a la deshidratación en los frutos cítricos.

Introducción

El estrés hídrico durante la postcosecha es uno de los factores más importantes reduciendo la calidad externa y, por tanto, el valor comercial de la fruta fresca. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la deshidratación de los frutos es escaso (Alférez et al., 2008, Deluc et al., 2009; Romero et al., 2012b). Las aproximaciones transcriptómicas de alto rendimiento han puesto de manifiesto la relevancia de las respuestas moleculares tempranas de los frutos cítricos para contrarrestar la pérdida de agua y los posibles efectos deletéreos que afectan a su calidad externa cuando se someten a este estrés (Romero et al., 2012b).

El ABA juega un papel crucial en el cierre estomático y, por tanto, es clave en el control de la pérdida de agua (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2007) en frutos, como los cítricos, que contienen un elevado número de estomas en las capas externas de la piel. De hecho, Romero et al. (2012b) demostraron que tanto rutas dependientes como independientes de ABA intervienen en la respuesta a la deshidratación postcosecha de los frutos cítricos. La obtención de mutantes artificiales de frutos en plantas leñosas es escasa. Por eso, el acceso a mutantes espontáneos es de un especial interés científico en este tipo de plantas. Distintos trabajos han tratado de entender los mecanismos fisiológicos (Alférez et al., 2005; Sala et al., 2005) y moleculares (Romero et al., 2012b) que vinculan el ABA y la deshidratación en frutos de Citrus haciendo uso de un mutante espontáneo específico de fruto y deficiente en ABA de la naranja ‘Navelate’ (Citrus sinensis L. Osbeck), llamado ‘Pinalate’ (Figura 1). Los frutos de este mutante presentan un bloqueo parcial en la ruta de biosíntesis de carotenoides, causando una coloración amarilla y una deficiencia en ABA específica de fruto (Rodrigo et al., 2003).

Figura 1: Frutos de naranjas ‘Navelate’ y su mutante espontáneo deficiente en ABA y de coloración amarilla ‘Pinalate’.

Trabajos recientes sobre los mecanismos de señalización en la respuesta al ABA han sido particularmente relevantes para la agricultura ya que han profundizado en las bases moleculares implicadas en la tolerancia al estrés hídrico. Así, el descubrimiento de los receptores solubles de ABA (PYR/PYL/RCAR) (Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Santiago et al., 2009; Nishimura et al., 2010) y la identificación del complejo formado por las proteínas fosfatasas tipo 2CA y la subclase III de proteínas quinasas tipo SNF1 (PP2CA-SnRK2) en la ruta de señalización de Arabidopsis thaliana (Umezawa et al., 2009), han animado a realizar nuevas investigaciones enfocadas a mejorar la resistencia a la deshidratación en distintos cultivos (Li et al., 2009; Chai et al., 2011; Sun et al., 2011; Kim et al., 2012; Li et al., 2012). Recientemente, los componentes del núcleo de señalización del ABA se han identificado en cítricos y su regulación transcripcional se ha estudiado durante el desarrollo y la maduración del fruto, y en hojas sometidas a estrés hídrico (Romero et al., 2012a). No obstante, el efecto de la deshidratación en la regulación transcripcional de estos elementos aún no se ha estudiado en ningún fruto. Por ello, el objetivo de este trabajo ha sido estudiar la regulación transcripcional de los componentes del sistema de percepción del ABA en frutos de ‘Navelate’ y su mutante deficiente en ABA ‘Pinalate’ almacenados bajo condiciones que causan un estrés hídrico moderado (70-75% HR y 12 °C).

Materiales y métodos

Material vegetal y tratamiento con ABA

Frutos maduros de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’ se cosecharon aleatoriamente de árboles del ‘Banco de Germoplasma de Cítricos’ del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA, Valencia, España). Los frutos de ‘Pinalate’ se dividieron en dos grupos, que se trataron con ABA 1 mM sumergiendo los frutos durante 1 min en una solución acuosa que contenía el 0.7% de etanol para disolver la hormona (grupo 1) o con agua conteniendo un 0.7% de etanol (solución control) (grupo 2) siguiendo el mismo protocolo. Los frutos se dejaron secar a temperatura ambiente y fueron almacenados inmediatamente a 12 °C y 70-75% HR hasta 6 semanas. El tratamiento con ABA se repitió cada 2 semanas para mantener altos los niveles de ABA a lo largo del almacenamiento. Periódicamente, se recogieron muestras de flavedo (parte externa de la piel) que fueron congeladas, homogeneizadas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C hasta su posterior análisis.

Estimación de la pérdida de agua y análisis de ABA

La susceptibilidad a la deshidratación de los frutos de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’, tratados o no con ABA, fue evaluada calculando el porcentaje de la pérdida de peso a lo largo del almacenamiento a 12 °C y 70-75% HR. El ABA se extrajo a partir de 1 g de peso fresco de tejido congelado y se analizó siguiendo el protocolo descrito por Lafuente et al. (1997).

Extracción de RNA y análisis por qRT-PCR

El RNA total se extrajo de las muestras de flavedo de ambos cultivares como describe Romero et al. (2012b). La transcripción reversa seguida de la cuantificación de la reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR) fue llevada a cabo en un ensayo de qRT-PCR de dos etapas (Romero et al., 2012b). Las secuencias de los cebadores específicos de cada uno de los genes analizados (ver Tabla 1 y Figura 3) se detallan en el trabajo publicado por Romero et al., (2012a).

Tabla 1: Análisis de expresión absoluta por qRT-PCR de los componentes del signalosoma de ABA en frutos de ‘Navelate’, ‘Pinalate’ y ‘Pinalate + ABA’ bajo condiciones de estrés hídrico. Los números son medias de tres réplicas biológicas analizadas por duplicado y corresponden al número de copias de cada gen por µg de RNA total. Las diferencias significativas (P ≤ 0.05) para un mismo tiempo de almacenamiento están indicadas por diferentes letras. Los asteriscos indican diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los frutos de ‘Pinalate’ tratados o no con ABA para el mismo periodo de almacenamiento.

Diseño estadístico

Los resultados son medias de tres réplicas biológicas ± SE. La comparación de medias utilizando el test de Tukey se realizó para determinar si los valores medios eran significativamente diferentes (P ≤ 0.05) entre variedades para un mismo periodo de muestreo.

Resultados y discusión

Los resultados indican que la expresión de algunos de los elementos del signalosoma de ABA están diferencialmente regulados en el flavedo de los frutos cosechados de ambos cultivares sometidos a estrés hídrico, lo que puede estar relacionado con la menor capacidad de los frutos del mutante para incrementar los niveles endógenos de ABA cuando se almacenan a 70-75% HR y/o con su mayor susceptibilidad a la deshidratación (Figura 2). Así, aunque sólo se encontraron pequeñas diferencias en la expresión de los receptores de ABA (CsPYR/PYL/RCARs) entre los frutos de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’ en respuesta a la deshidratación para el mismo periodo de almacenamiento (Figura 3A), las diferencias en la expresión de los reguladores negativos (CsPP2CAs) fueron relevantes (Figura 3B).

Esto concuerda con observaciones previas que mostraban que la diferente capacidad de ambos cultivares para incrementar los niveles de ABA durante la maduración del frutos tenía poco efecto sobre la expresión de los reguladores positivos (CsPYR/PYL/RCARs and CsSnRK2s) de la ruta de señalización del ABA (Romero et al., 2012a). También es importante señalar que se observaron pocos cambios en la regulación de los receptores de ABA y las proteínas quinasas entre hojas de cítricos no estresadas y hojas sometidas a deshidratación severa que causaron un incremento de 15 veces en el contenido de ABA y una pérdida de peso del 20% (Romero et al., 2012a). Así pues, los resultados del presente trabajo apoyan la idea de que la expresión de los genes PYR/PYL/RCAR apenas se afectan por el contenido endógeno de ABA en ‘Citrus’, independientemente del tejido y de las condiciones fisiológicas o de estrés examinadas.

Figura 2: Porcentaje de pérdida de peso (A) y contenido en ABA (B) en frutos de ‘Navelate’ (cuadrados) y ‘Pinalate’ (círculos), tratados (blanco) o no (negro) con ABA y almacenados bajo condiciones que causan un estrés hídrico moderado (70-75% HR y 12 °C). Los valores son medias ± SE a partir de 3 réplicas biológicas para cada tiempo de muestreo y variedad analizadas. Las diferencias significativas (P ≤ 0.05) para el mismo periodo de almacenamiento están indicadas por diferentes letras.

El ABA exógeno indujo, principalmente, la expresión de los receptores de ABA a 1 semana y al final del almacenamiento (Figura 3A), mientras que los niveles de transcritos de los componentes del complejo PP2CA-SnRK2 fueron inducidos a 1 semana (Figura 3B y 3C). El tratamiento incrementó los niveles de la hormona en el flavedo (Figura 2A) pero no modificó significativamente (P ≤ 0.05) la pérdida de peso de los frutos del mutante (Figura 2B). Nuestros resultados en ‘Citrus’ están de acuerdo con otros encontrados en frutos de tomate tratados con ABA y en hojas de ‘Vitis’ y tomate expuestas a estrés hídrico (Sun et al., 2011; Li et al., 2012), aunque en plántulas de ‘Arabidopsis’ se ha observado que los genes PYR/PYL/RCAR pueden estar regulados por el estrés hídrico y/o por el contenido en ABA (Szostkiewicz et al., 2010). Los resultados presentados aquí también demuestran que los niveles de transcrito del gen ‘CsPYL9’, que fue el receptor de ABA con mayor expresión (Tabla 1), incrementaron con la deshidratación del fruto. En cambio, este gen fue reprimido por la deshidratación en hojas y durante la maduración del fruto (Romero et al., 2012a). Estos resultados, junto al hecho de que la expresión del gen ‘CsPYL2’ fue detectada en hojas (Romero et al., 2012a) pero no en flavedo (Tabla 1 y Figura 3A), resaltan la relevancia de la regulación diferencial y la especificidad de tejido de los distintos genes de esta familia, y puede sugerir el efecto de la severidad del estrés en la modulación de la percepción y respuesta al ABA.

Las diferencias en los niveles de expresión de los genes CsPP2CAs entre los frutos de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’ en respuesta a la deshidratación fueron relevantes, lo que concuerda con el hecho de que estos genes funcionan como reguladores negativos de la ruta de señalización del ABA y son altamente inducidos en respuesta a la hormona en plantas (Merlot et al., 2001; Saez et al., 2004; Li et al., 2009). Así, encontramos que el estrés hídrico moderado es capaz de inducir la expresión génica de las CsPP2CAs en los frutos de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’ con la acumulación de ABA (Figura 2B), lo que está de acuerdo con resultados previos en hojas de Arabidopsis y tomate, y también con los cambios observados en la expresión de estos genes en frutos de fresa y tomate durante la maduración (Szostkiewicz et al., 2010; Chai et al., 2011; Sun et al., 2011). Como ocurrió durante la maduración del fruto (Romero et al., 2012a), todas las CsPP2CAs, excepto CsAHG1, siguieron un patrón de expresión similar en los frutos de ambos cultivares durante la deshidratación moderada (Figura 3B), aunque los niveles absolutos de transcritos en el mutante deficiente en ABA fueron significativamente menores a los observados en los frutos de la línea parental (Tabla 1). Del mismo modo, las hojas no deshidratadas mostraron patrones de expresión en las CsPP2CAs muy similares a los de las hojas estresadas, aunque la acumulación de transcritos fue inferior en las hojas control, lo que puede estar asociado a sus menores niveles de ABA (Romero et al., 2012a). Así pues, la expresión de las CsPP2CAs parece estar estrechamente regulada por los niveles endógenos de ABA bajo condiciones fisiológicas y de estrés, independientemente del tejido y de la severidad del estrés impuesto.

Figura 3: Análisis de expresión relativa por qRT-PCR de los receptores de ABA CsPYR/PYL/RCAR (A), los reguladores negativos CsPP2CAs (B) y las proteínas quinasas CsSnRK2s (C) en frutos de ‘Navelate’ (cuadrados) y ‘Pinalate’ (círculos), tratados (blanco) o no (negro) con ABA y almacenados bajo condiciones que causan un estrés hídrico moderado (70-75% HR y 12 °C). Los valores de expresión son relativos a los obtenidos en los frutos de ‘Navelate’ recién cosechados. Los valores son medias ± SE a partir de 3 réplicas biológicas para cada tiempo de muestreo y variedad analizada. Las diferencias significativas (P ≤ 0.05) para el mismo periodo de almacenamiento están indicadas por diferentes letras. Los asteriscos indican diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los frutos de ‘Pinalate’ tratados o no con ABA para el mismo periodo de almacenamiento.

Entre las proteínas quinasas que forman parte del complejo CsPP2CA-SnRK2, es interesante destacar que la quinasa CsSnRK2.6 se expresó más en hojas (Romero et al., 2012a) y frutos (Tabla 1) que la quinasa CsSnRK2.2, y que los cambios en la CsSnRK2.6 en respuesta a la deshidratación parecen ser específicos de tejido. Este gen fue reprimido en ambos cultivares durante la deshidratación del fruto concomitantemente con el aumento en ABA endógeno (Figura 3C), tal y como ocurre durante la maduración del fruto (Romero et al., 2012a), pero fue inducido por el estrés hídrico en hojas (Romero et al., 2012a). Por el contrario, la expresión del gen CsSnRK2.2 disminuyó con la deshidratación de los frutos (Figura 3C) y hojas (Romero et al., 2012a), y también durante la maduración del fruto de ambos cultivares con los incrementos en ABA. Otro hecho a destacar es que se encontraron diferencias significativas en el patrón de expresión de este gen entre los frutos de ‘Navelate’ y ‘Pinalate’ en respuesta al estrés hídrico.

En resumen, los resultados de este trabajo exponen por primera vez la regulación transcripcional de los componentes del signalosoma de ABA en frutos sometidos a condiciones de estrés hídrico. Las diferencias en los niveles de transcritos de los receptores de ABA y las proteínas quinasas entre los frutos de ‘Navelate’ y su mutante deficiente en ABA ‘Pinalate’ en respuesta a la deshidratación son poco relevantes. Sin embargo, la expresión génica de las CsPP2CAs fue sustancialmente regulada por el contenido en ABA y mostró diferencias significativas entre ambas variedades. Además, los resultados indican que la regulación transcripcional de los receptores de ABA y las proteínas quinasas podría estar diferencialmente afectada por la especificidad de tejido, la severidad del estrés y la procedencia de la señal de ABA desde un estímulo de desarrollo o de estrés. En cambio, las CsPP2CAs, reguladores negativos de la ruta, han mostrado una respuesta consistente en todas las condiciones y tejidos ensayados, lo que sugiere que estos componentes son posibles dianas para mejorar la tolerancia a la deshidratación en cítricos.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Luis Navarro (IVIA) que nos permitiera el uso del Banco de Germoplasma de Cítricos. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (AGL2006-09496, AGL2009-11969 y AGL2009-11558) y por la Generalitat Valenciana (PROMETEO/2010/010). P. Romero es receptor de una beca FPI del Ministerio de Ciencia y Tecnología.

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