Las mutaciones naturales han sido la base de la agricultura durante miles de años

Las mutaciones son cambios en el DNA o en los cromosomas. En su mayoría, estos cambios solo afectan a un único nucleótido o a una región muy pequeña del DNA de los miles de millones de nucleótidos que conforman el genoma, pero son los responsables de la variabilidad genética que observamos. Sin mutaciones, todos seríamos iguales, y lo que es más importante, no habría posibilidades para la evolución y la adaptación. Por tanto, en lugar de una excepción, podemos decir que todos los individuos de una especies somos mutantes para unos u otros genes. En el caso de las plantas, esta variabilidad genética ha sido aprovechada por el hombre desde el principio de la agricultura, pues la domesticación de las especies siempre ha ido acompañada de la selección de aquellas variantes genéticas (o mutaciones) más favorables para el cultivo, la recolección, o la calidad de los frutos, semillas, tubérculos, etc. A lo largo del tiempo esta selección continuada en diferentes lugares del mundo ha originado distintas variedades adaptadas a las condiciones edafoclimáticas y de manejo del lugar. Así han surgido las variedades tradicionales o locales, variedades que hoy guardamos como si de oro se tratara en los bancos de germoplasma públicos y privados de todo el mundo.

Las variedades locales vegetales representan la variabilidad genética natural de la especie, una variabilidad fundamental para la mejora genética de los cultivos (resistencias genéticas a plagas y enfermedades, tolerancias a estreses abióticos, nuevas formas, tamaños y colores en flores y frutos, etc.). Cuando un mejorador de plantas está desarrollando una nueva variedad, echa mano de la enorme variación genética que nos ha brindado la naturaleza a lo largo de la evolución de la especie. Las mutaciones naturales han sido, por tanto, la base de la agricultura durante miles de años. Pero, ¿qué podemos hacer si no detectamos la variación que buscamos entre las variedades locales y comerciales de la especie cultivada o especies afines? La solución pasa por inducir más variabilidad genética.

En la actualidad existen dos soluciones para inducir variabilidad genética en la mejora genética de especies cultivadas. La primera de ellas es aumentar las tasas de mutaciones naturales en el DNA mediante el uso de mutágenos químicos o físicos. Se generan así miles de nuevas mutaciones al azar, que posteriormente debemos de rastrear para identificar y seleccionar las variantes que nos interesan. Las mutaciones inducidas son iguales que las naturales, por lo que las variedades que se generan a partir de mutaciones inducidas se pueden registrar como variedades tradicionales. La segunda solución es utilizar la ingeniería genética para dirigir las mutaciones en un gen concreto de la planta, o para utilizar la variabilidad que brindan el resto de las especies (virus, bacterias, animales y vegetales), transfiriendo un gen desde cualquier especie a la especie cultivada. Estas variedades producto de la ingeniería genética se deben registrar como variedades transgénicas u organismos modificados genéticamente (OMGs). En el grupo de investigación 'Genética de hortícolas' de la Universidad de Almería hemos optado por la primera solución.

El desarrollo de la genómica y de las técnicas de secuenciación y genotipado masivos nos permiten hacer screenings masivos de miles de mutantes, identificando mutaciones en genes concretos. Conocida la secuencia del genoma, la mutagénesis artificial nos ayuda a descubrir la función individual de los más de 25.000 genes que puede tener una planta (Genómica funcional), pero a la vez, el uso de mutágenos genera variantes alélicas que podemos seleccionar para la mejora genética del cultivo. Por todo ello, en la actualidad contamos con plataformas de mutantes en muchas especies hortícolas como tomate (Minoia et al., 2010), melón (González et al., 2011), o pepino (Boualem et al., 2014).

Dado que nuestro grupo de investigación trabaja en mejora genética de calabacín, hemos desarrollado una colección de más de de 3.700 familias mutantes de Cucurbita pepo (García et al., 2016). Para ello hemos utilizado el mutagéno químico metanosulfonato de etilo (EMS) para tratar las semillas de una variedad tradicional de calabacín español (MUC-16). Esta misma variedad es la que se ha utilizado para secuenciar el transcriptoma y el genoma de calabacín (https://cucurbigene.upv.es/), en cuya consecución hemos colaborado con los grupos de la Dra. Belén Picó y el DR. José Balnca de la UPV. Las mutaciones generadas serán fáciles de identificar, pues suponen variantes alélicas diferentes a las del genoma de referencia.

Para caracterizar la calidad de la colección de mutantes de calabacín de la UAL, hemos estudiado la variabilidad morfológica de 10 plántulas por familia, lo que ha supuesto la evaluación de 37.510 plántulas de calabacín en semillero (Figura 1, Tabla 1). A la vez hemos recogido muestras de hoja de cada planta, y una vez agrupadas por familias hemos extraído el DNA de las 3.751 familias. Esta plataforma del ADN de todas las familias mutantes es lo que se llama plataforma de TILLING (Target Induced Local Lessions in Genomes), y se utiliza para hacer screenings basados en cambios en el DNA. El DNA de algunas de las familias ha sido ya secuenciado mediante NGS (New Generation Sequecing). A partir de esta secuenciación, y centrándonos en las mutaciones que de manera más frecuente origina el mutágeno EMS (C>T o G>A), hemos concluido que nuestros mutantes tienen una media de 5 mutaciones/Mb, una tasa de mutación muy similar a las detectadas en otras colecciones de mutantes de plantas (Gonzalez et al., 2011; Boualem et al., 2014). El porcentaje de variación fenotípica, así como las tasas de mutación detectadas en la colección de calabacín, son muy altas, demostrando que la colección tiene una excelente calidad.

Una vez conocida la calidad de la colección de mutantes, se están realizando diferentes screenings para caracteres agronómicos de interés. Para ello utilizamos dos estrategias: primero identificamos el fenotipo mutante de interés y posteriormente la mutación y el gen responsable del fenotipo (Genéitica directa); o primero identificamos las variantes alélicas en el gen de interés mediante TILLING, y posteriormente comprobamos si el mutante tiene interés para el carácter en el que estamos interesados (Genética inversa). La primera de las estrategias ha generado ya resultados de interés para la mejora genética de calabacín.

Dado el gran número de plantas que tenemos que manejar en cada uno de los screenings (más de 37.000 plantas), buscamos un test de plántulas que esté correlacionado con el carácter de interés en la planta adulta. El primero de los screenings que hicimos fue para insensibilidad a etileno, pues el etileno regula un gran número de caracteres de interés agronómico: expresión sexual (Manzano et al., 2010, 2011, 2013), cuajado del fruto y partenocarpia (Martínez et al., 2013, 2014), daños por frío durante la poscosecha del fruto (Megías et al., 2014, 2016).

Para buscar mutantes insensibles al etileno en la colección, en lugar de crecer las 38.000 plantas en el campo y evaluar sus flores y frutos, lo que hicimos fue utilizar el test de triple respuesta a etileno en plántulas etioladas (Figura 2). Cuando las plántulas crecen en oscuridad en presencia de etileno, éstas no se etiolan y muestran un acortamiento del hipocotilo y las raíces, a la vez que un engrosamiento del hipocotilo (Figura 2). Por tanto, cualquier plántula que en presencia de etileno no mostrara esta triple respuesta la podemos considerar insensible a etileno. Así hemos aislado 4 mutantes de calabacín con insensibilidad parcial al etileno: ein1, ein2, ein3 y Ein4 (García et al., 2015; García et al., 2016).

Una vez identificados, los mutantes de esas familias se han cultivado en campo para evaluar sus características agronómicas. En este caso, las cuatro familias mutantes mostraron todas ellas alteraciones en la expresión sexual y en el crecimiento del fruto (Figura 3). Tres de las mutaciones (ein1, ein2 y ein3) producen una conversión de flores femeninas en hermafroditas, y de plantas monoicas en andromonoicas, a la vez que muestran un crecimiento partenocárpico de sus frutos, un carácter de enorme importancia en la mejora genética de calabacín, pues en la actualidad el crecimiento de los frutos de calabacín en invernadero se induce con auxinas sínteticas, una práctica que deja residuos en los frutos y para la que estamos buscando alternativas más sostenibles. El mutante Ein4 mostró un fenotipo androico, es decir, solo produjo flores masculinas. Estamos estudiando la posibilidad de que este mutante androico pueda ser utilizado como polinizador en el cultivo de calabacín ecológico de invernadero, pues el cultivo ecológico no permite el uso de hormonas sintéticas, y las variedades de calabacín comerciales no producen flores masculinas durante los cultivos de invierno, lo que imposibilita también la polinización con abejas o abejorros.

Para tratar de buscar las mutaciones implicadas en el fenotipo de estos mutantes, estamos comparando la secuencia obtenida mediante NGS entre plantas WT y mutantes. El estudio comparativo nos ha permitido detectar una mutación en un gen de etileno que cosegrega con el fenotipo mutante de ein2 (García et al., en preparación). Este gen está siendo caracterizado actualmente en nuestro laboratorio.

Los frutos de calabacín son muy sensibles a la frigocoservación. El transporte y almacenamiento a 4 °C produce diferentes síntomas de daños por frío, que van asociados a una elevada inducción de etileno en las variedades más sensibles al frío (Megías et al., 2014). Además, los frutos de algunas variedades responden positivamente a los tratamientos con el inhibidor de etileno 1-MCP (Megías et al., 2016; 2017). Esperábamos, por tanto, que los mutantes insensibles a etileno tengan una mejor postcosecha y sean más tolerantes a la frigocoservación. En el primero de los ensayos que hemos realizado, los frutos del mutante ein1 mostraron una reducción de sus daños por frío respecto a los frutos WT, pero los de los mutantes ein2 y ein3 no mostraron diferencias significativas con los frutos WT (Figura 4).

Diversos estudios llevados a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Dolores Garrido de la UGR, nos han permitido concluir que los daños por frío en el fruto de calabacín están asociados con la inducción de catabolitos de estrés oxidativo (H₂O₂ y MDA) (Carvajal et al., 2011; Megías et al., 2015; Palma et al., 2016). Por ello, en la actualidad estamos realizando un screening de la colección de mutantes para tolerancia a estrés oxidativo. Los tratamientos con agua oxigenada son capaces de reducir el crecimiento de la radícula de las semillas en germinación (Figura 4). Por ello, y con el fin de identificar mutantes tolerantes al estrés oxiativo, estamos tratando las semillas en germinación con una solución de peróxido de hidrógeno (H₂O^₂) y aminotriazol (AT). Este último inhibe la actividad catalasa (una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua), haciendo que el H₂O₂ sea aún más tóxico. Las semillas tratadas reducen el crecimiento de su radícula (Figura 5), de forma que cualquier semilla tolerante al tratamiento sería fácilmente identificada. Este test ha sido ya utilizado con éxito en otras especies vegetales (Gechev et al. 2008).

Figura 5. Semillas de una familia de mutantes de calabacín germinada con agua (izquierda) o con peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y aminotriazol (AT) (derecha).

Hasta el momento hemos hecho el screening de aproximadamente 1000 familias M2 con H₂0₂ + AT y se ha detectado una familia donde segregan plantas más tolerantes al estrés oxidativo. Se están cultivando las plantas más tolerantes de esta familia para obtener semilla M3 y semilla de backcrossing (BC1) con MUC-16, el fondo genético donde hemos inducido las mutaciones. A partir de las generaciones M3 y BC2 iniciaremos el fenotipado de las plantas en campo y evaluaremos el potencial agronómico de los mutantes.

Uno de los problemas más importantes de la horticultura almeriense bajo invernadero son las plagas y enfermedades, esencialmente las virosis que se transmiten por insectos, y cuyo control escapa de cualquier tratamiento químico. En el caso de calabacín, las mayores pérdidas de producción y de rentabilidad del cultivo se producen por oídio y por el virus ToLCNDV (Tomato Leaf Curl New Delhi Virus), un Begomovirus trasmitido por mosca blanca que es capaz de infectar a todas las cucurbitáceas pero que está teniendo efectos devastadores sobre los cultivos de calabacín de Almería y Murcia. En conlaboración con la UPV hemos identificado las primeras resistencias genéticas a ToLCNDV en el género Curcubita (Saéz et al., 2016), y estamos investigando para detectar resistencias genéticas a diferentes virus en nuestra colección de mutantes. Estos screenings masivos de plantas se van a acelerar con una nueva infraestructura científica que se le ha concedido recientemente a la UAL para el fenotipado masivo de plantas hortícolas (Figura 6).

Agradecimientos

Esta investigación está financiada por el proyecto del plan nacional de investigación AGL2014-54598-C2-1-R) y por el Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía P12-AGR-1423.

Referencias bibliográficas

• Boualem, A., Fleurier, S., Troadec, C., Audigier, P., Kumar, A.P.K., Chatterjee, M., Alsadon, A.A., Sadder, M.T., Wahb-Allah, M.A., Al-Doss, A.A. & Bendahmane, A. 2014. Development of a Cucumis sativus TILLING Platform for forward and reverse genetics. PLoS ONE. 9:e97963.
• Carvajal, F., Martínez, C., Jamilena, M. & Garrido, D. 2011. Differential response of zucchini varieties to low storage temperature. Scientia Horticulturae 130:90-96.
• García, A., Manzano, S., Martínez, C., Megías, Z., Gázquez, J.C. & Jamilena, M. 2015. Isolation and characterisation of ethylene insensitive mutants from a collection of Cucurbita pepo L. In: Gomez Guillamon ML, Perez Alfocea F (eds) Cucurbits 2015. Book of Abstracts. Cartagena. ISHS.
• García, A., Manzano, S., Aguado, E.Martínez, C., Megías, Z., Martinez, C., Garrido, D. & Jamilena, M. 2016. Isolation and characterization of three recessive andromonoecious mutants of Cucurbita pepo. Cucurbitaceae 2016. Warsaw, Poland.
• González, M., Xu, M., Esteras, C., Roig, C., Monforte, A. J., Troadec, C., Pujol, M., Nuez, F., Bendahmane, A., Garcia-Mas, J. & Picó, B. 2011. Towards a TILLING platform for functional genomics in Piel de Sapo melons. BMC Research Notes. 4:289.
• Gechev, T. S., Ferwerda, M. A., Mehterov, N., Laloi, C., Qureshi, M. K. & Hille, J. (2008). Arabidopsis AAL-toxin-resistant mutant atr1 shows enhanced tolerance to programmed cell death induced by reactive oxygen species. Biochemical and biophysical research communications, 375(4), 639-644.
• Manzano, S., Martínez, C., Domínguez, V., Avalos, E., Garrido, D., Gómez, P. & Jamilena, M. 2010. A major gene conferring reduced ethylene sensitivity and maleness in Cucurbita pepo. J Plant Growth Regul. 29, 73-80.
• Manzano, S., Martínez, C., Megías, Z., Gómez, P., Garrido, D. & Jamilena, M. 2011. The role of ethylene and brassinosteroids in the control of sex expression and flower development in Cucurbita pepo. J. Plant Growth Regul. 65, 213-221.
• Manzano, S., Martínez, C., Megías, Z., Garrido, D. & Jamilena, M. 2013. Involvement of ethylene biosynthesis and signalling in the transition from male to female flowering in the monoecious Cucurbita pepo. J. Plant Growth Regul. 32, 789-798.
• Martínez C, Manzano S, Megias Z, Garrido D, Picó B & Jamilena M. 2013. Involvement of ethylene biosynthesis and signalling in fruit set and early fruit development in zucchini squash (Cucurbita pepo L.). BMC Plant Biol 13,139
• Martínez C, Manzano S, Megias Z, Boualem A, Garrido D, Bendahmane A & Jamilena M. 2014. Molecular and functional characterization of CpACS27A gene reveals its involvement in monoecy instability and other associated traits in squash (Cucurbita pepo L.). Planta. 239, 1201-1215
• Martínez C, Manzano S, Megias Z, Garrido D. & Jamilena M. 2014. Sources of parthenocarpy for Zucchini breeding: relationship with ethylene production and sensitivity. Euphytica. 200(3), 349-362
• Megías, Z., Martinez, C., Manzano, S., Barrera, A., Rosales, R., Valenzuela, J.L., Garrido, D. & Jamilena, M. 2014. Cold-induced ethylene in relation to chilling injury and chilling sensitivity in the non-climacteric fruit of zucchini (Cucurbita pepo L.). LWT-Food Science and Technology 57, n194-199.
• Megías, Z., Martínez, C., Manzano, S., García, A., Del Mar Rebolloso-Fuentes, M., Garrido, D., Valenzuela, J.L. & Jamilena, M. 2015. Individual shrink wrapping of zucchini fruit improves postharvest chilling tolerance associated with a reduction in ethylene production and oxidative stress metabolites. PLoS ONE 10(7) e0133058.
• Megías, Z., Martínez, C., Manzano, S., García, A., Rebolloso-Fuentes, M. del Mar, Valenzuela, J.L., Garrido, D. & Jamilena, M. 2016. Ethylene biosynthesis and signaling elements involved in chilling injury and other postharvest quality traits in the non-climacteric fruit of zucchini (Cucurbita pepo). Postharvest Biology and Technology 113, 48-57.
• Megías, Z, Martínez, C, Manzano, S, García, A, Aguado, E, Garrido, D, Rebolloso, MM, Valenzuela, JL &Jamilena, M. 2017. Postharvest cold tolerance in summer squash and its association with reduced cold-induced ethylene production. Euphytica 213(1).
• Minoia S, Petrozza A, D'Onofrio O, Piron F, Mosca G, Sozio G, Cellini F, Bendahmane A, & Carriero F. 2010. A new mutant genetic resource for tomato crop improvement by TILLING technology. BMC Res Notes. 12, 3:69.
• Palma, F., Carvajal, F., Jamilena, M. & Garrido, D. 2016. Putrescine treatment increases the antioxidant response and carbohydrate content in zucchini fruit stored at low temperature. Postharvest Biology and Technology 118:68-70.
• Sáez C, C. Martínez, M. Ferriol, S. Manzano, L. Velasco, M. Jamilena, C. López & B. Picó. 2016. Resistance to Tomato leaf curl New Delhi virus in Cucurbita spp. Annals of Applied Biology 169, 91–105.