Un clon de la variedad Tempranillo para vinos con alto contenido fenólico

A partir de la segunda mitad del siglo XX, la selección clonal ha sido la principal estrategia para seleccionar genotipos de variedades de vid de confirmada identidad genética, buen estado fitosanitario y un buen nivel de producción. Esta selección clonal ha sido utilizada para la propagación mediante injertos en los viveros. En España, la selección clonal ha sido responsable en parte del aumento de la productividad de la viticultura a lo largo de las últimas décadas del siglo XX (Ibáñez et al., 2015). La viticultura moderna está evolucionando desde objetivos de rendimiento en la producción, a objetivos más relacionados con la adaptación al cambio climático, la sostenibilidad y con la calidad.

En relación a la selección clonal, hay dudas acerca de si las variedades actuales contienen suficiente variación somática para permitir la selección de variantes que difieran en calidad y rasgos adaptativos. Ciertamente, esto no será fácil para la mayoría de las variedades de uva, pero en el caso de las variedades más comunes es posible identificar variantes de interés. Este es el caso de la variedad Tempranillo, extensamente cultivada en la Península Ibérica, con más de 200.000 ha de cultivo en España en el año 2020. Por este motivo, se está realizando un importante esfuerzo en diferentes regiones vitivinícolas para preservar accesiones de cepas viejas de la variedad Tempranillo, que podrían constituir futuras fuentes de variación fenotípica. Concretamente, en lo relativo al color de la uva, se han identificado variantes somáticas que difieren en el color de las bayas, y que han dado lugar a la nueva variedad Tempranillo Blanco, o a las variantes grises o royas.

Los compuestos fenólicos, comúnmente denominados polifenoles, son componentes intrínsecos que la uva produce como respuesta a situaciones de estrés biótico o abiótico. En cuanto al vino, los polifenoles son los principales responsables de aspectos clave de su calidad, estabilidad y complejidad (Hornedo-Ortega et al., 2020), y resultan además beneficiosos para la salud, mediante un consumo moderado de vino. Los compuestos fenólicos constituyen una familia heterogénea de compuestos químicos, que se pueden dividir en dos categorías muy amplias, flavonoides y no-flavonoides. Los primeros incluyen los antocianinos fuertemente pigmentados y responsables del color de los vinos tintos y también compuestos no pigmentados, como las procianidinas y proantocianidinas (taninos condensados) y los flavonoles. Estos últimos son responsables en gran medida de la estabilidad de los vinos, así como de sus atributos sensoriales relacionados con el sabor y la astringencia. Por otro lado, los no-flavonoides incluyen los ácidos hidroxicinamicos e hidroxibenzoicos y los estilbenos, cuyo componente más conocido es el resveratrol al que se han atribuido diferentes funciones biológicas.

En el marco de la selección clonal y los compuestos fenólicos de la uva, se ha identificado una nueva variante, conocida como 'Tempranillo negro', dentro de una colección de clones de Tempranillo en viveros Vitis Navarra, caracterizada por un intenso color negro de la baya. En este estudio se ha llevado a cabo una caracterización completa del perfil fenólico de uva y vino de 'Tempranillo negro' o VN21, mediante técnicas de cromatografía líquida avanzada, utilizando como referencia el clon RJ43, uno de los más cultivados en la DOCa. la Rioja (Royo et al., 2021). Además, se analizó la transferencia de los componentes fenólicos de la uva al vino a lo largo del proceso de fermentación, mostrando importantes diferencias cuantitativas en los perfiles fenólicos de los vinos del clon VN21.

Material Vegetal

El origen del clon de Tempranillo VN21 se remonta al año 1990, año en el que se estableció un ensayo de diferentes tipos de riego en la Universidad Politécnica de Madrid. Con este fin, se plantó una selección masal de Rioja Alavesa sobre el portainjerto 110R. Entre los años 1993 y 2000 el equipo de José Ramón Lissarrague detectó una cepa con unas características peculiares, como una baja compacidad del racimo y un color de la uva más intenso de lo habitual. Vitis Navarra empezó el proceso de selección clonal de este biotipo teniendo que sanear el clon mediante regeneración meristemática ya que contenía el virus del jaspeado. A partir de las plantas libres de virus se establecieron los campos de homologación y caracterización y se inscribió el clon Tempranillo VN21 en el registro.

Como referencia para comparar la composición fenólica en este estudio se ha utilizado el clon de Tempranillo RJ43, uno de los clones más utilizados en la DOCa. Rioja (España), cultivado en la misma parcela que VN21 y en las mismas condiciones ambientales.

El muestreo se llevó a cabo mediante la recogida de racimos maduros (17/09/2019). Se seleccionaron las uvas para el análisis de compuestos fenólicos en hollejo y en semilla. En paralelo se recogieron 75 kg aproximadamente de uva que se dividieron en 3 lotes para proceder a su vinificación en la Bodega Experimental del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV).

Medidas de intensidad de color

El color de las uvas y de los vinos se caracterizó con los parámetros colorimétricos en el espacio tridimensional CIELAB (L*a*b*) con un colorímetro CR-400 (Konica Minolta) para las uvas y un espectrofotómetro Agilent Cary 60 UV-Vis para el vino.

Elaboración del vino

La vinificación de los dos clones se realizó el mismo día de la vendimia, por triplicado para cada clon. Los racimos se despalillaron y los mostos se fermentaron con la adición de un 8% de metabisulfito potásico, y 20 g/hL de levadura Uvaferm VRB (Lallemand). La fermentación alcohólica se realizó a 20 °C durante nueve días, controlando su evolución mediante medida de la densidad del mosto. Tras el prensado, el vino reposó (20 °C) durante siete días. A continuación, la fermentación maloláctica se realizó a 20 °C con la inoculación de 1 g/hL de la bacteria comercial Oenococcus oeni cepa 203 LalvinSilka (Lallemand). La evolución de la fermentación maloláctica se comprobó mediante el análisis enzimático de la relación glucosa/fructosa y de la concentración de ácido málico (MIURA One enological analyzer, TDI Barcelona).

A lo largo del proceso de fermentación, se tomaron 10 muestras (desde mosto hasta vino embotellado) que se almacenaron a -80 °C hasta el análisis de su perfil fenólico.

Determinación del perfil fenólico de uva y vino por UHPLC-QqQ-MS/MS

La extracción de los compuestos fenólicos del hollejo y de las semillas se realizó mediante extracción sólido-líquido (SLE) con una mezcla de metanol/agua Milli-Q/ácido fórmico (79:20:1, v/v/v). La caracterización del perfil fenólico de los clones VN21 y RJ43 (uva y vino) se llevó a cabo mediante un abordaje de metabolómica semidirigida por cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas (UHPLC-QqQ-MS/MS) (Shimadzu Nexera liquid chromatograph, Shimadzu Corporation, Japan) acoplado a AB Sciex 3200QTRAP mass spectrometer, Sciex, USA). Los compuestos fenólicos se identificaron comparando sus parámetros cromatográficos y los espectros de masas con patrones comerciales, o bien con datos de la literatura.

Análisis estadístico

Las comparaciones estadísticas entre los clones de Tempranillo VN21 y RJ43 se evaluaron mediante la prueba t de Student para cada una de las muestras de hollejo, semillas, mostos y vinos. La evolución de los compuestos fenólicos durante el proceso de vinificación, para cada clon de Tempranillo, se evaluó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba b de Tukey (p <0.05).

Caracterización fenotípica

Aunque el clon de Tempranillo negro (VN21) brota y florece al mismo tiempo que el clon de referencia RJ43, sus bayas maduran dos semanas antes. No obstante, ambos clones presentan un peso de baya y número de semillas similar (Royo et al., 2021). Tal y como se observa en la Figura 1A, las uvas de Tempranillo negro, muestran un aspecto más oscuro que las bayas del clon de referencia RJ43. Otra característica peculiar de las uvas de Tempranillo negro es la ausencia de ceras en su superficie, lo que intensifica su color negro y les aporta una apariencia más brillante. La determinación instrumental de color mediante la medida de las coordenadas CIELab confirmaron el color más intenso de las uvas y de los vinos de Tempranillo negro (Tabla 1). En relación a las semillas, las de Tempranillo negro son más pequeñas que las de RJ43, no germinan y una cuarta parte de ellas muestra coloración roja (Figura 1B), característica poco común en semillas de uva.

Figura 1. Detalle de bayas (A) y de semillas (B) del clon de referencia RJ43 y del clon 'Tempranillo negro' (VN21).

Tabla 1. Valores de las coordenadas CIELab para el clon de referencia RJ43 y el clon 'Tempranillo negro'.

Perfil de antocianos y fenoles no coloreados en hollejo y semillas de uva

Los antocianos son compuestos fenólicos pigmentados cuya tonalidad varía del azul al rojo-rosado. El análisis cromatográfico del extracto fenólico del hollejo reveló una mayor concentración de algunos antocianos minoritarios (derivados de peonidina y cianidina) en VN21, en relación a la referencia RJ43 (Figura 2A). Estas familias de antocianos tienen tonalidades en el espectro azul-rojo, lo que podría explicar la tonalidad negra más intensa de las bayas de VN21, unido a la falta de ceras en su superficie. El análisis de la composición fenólica de las semillas identificó la presencia de diferentes grupos de antocianos, fundamentalmente derivados de petunidina, en VN21, mientras que en las semillas de RJ43 no fueron detectados (Figura 2B).

En relación a la fracción de polifenoles no coloreados, el hollejo de VN21 presentó menor concentración de proantocianidinas y ácidos fenólicos que el de RJ43 (Figura 2C). Sin embargo, esta diferencia se invierte en la composición de las semillas, que acumulan seis veces más proantocianidinas o tres veces más ácidos fenólicos en VN21 (Figura 2 D). La concentración de los derivados de los flavonoles quercetina, isorhamnetina y syringetina es mayor en el hollejo de VN21, aunque la concentración total de flavonoles no mostró diferencias estadísticamente significativas entre ambos clones. Esta mayor acumulación de flavonoles también se observó en las semillas, destacando una mayor concentración de los derivados de quercetina en semilla de VN21. Finalmente, se detectó una concentración de estilbenos significativamente superior en las semillas de VN21 destacando la presencia de resveratrol (Figura 2 D). La singularidad en la composición fenólica de las semillas de VN21 podría estar relacionada con las alteraciones que presentan en su desarrollo (Figura 1 B).

Análisis comparativo de la concentración de compuestos fenólicos a lo largo de la vinificación de VN21 y RJ43

Tal y como se observa en la Figura 3, las diferencias detectadas en la concentración de antocianos y fenoles no coloreados en hollejo y semillas de VN21 y RJ43 se potenciaron en los mostos, fundamentalmente durante la fase de fermentación alcohólica, manteniéndose a lo largo del proceso de vinificación hasta el vino final embotellado.

El análisis de la cinética de extracción durante la vinificación indica que, a partir del segundo día de la fermentación alcohólica, los mostos de Tempranillo negro presentaron una concentración significativamente superior de antocianos y de todos los grupos de compuestos fenólicos no coloreados (proantocianidinas, flavanoles, ácidos fenólicos y estilbenos) que los mostos de RJ43. Estas diferencias se expresaron en un mayor contenido de polifenoles totales en VN21 que se mantuvo durante todo el proceso de vinificación, hasta el embotellado (Figura 3).

¿Cómo se explican las diferencias entre los clones de Tempranillo VN21 y RJ43 en la cinética de extracción de compuestos fenólicos durante la vinificación?

La morfología similar de las uvas de cada clon, las mismas condiciones ambiente de cultivo y las mínimas diferencias observadas en la composición fenólica del hollejo no terminan de explicar las importantes diferencias observadas en la concentración fenólica de mostos durante la vinificación de los dos clones. La mayor concentración de antocianos y fenoles no coloreados en mostos y vinos de VN21 podrían deberse a diferentes factores (He et al., 2012). Por un lado, las semillas poco comunes de VN21 con un elevado contenido de fenoles podrían contribuir especialmente con un aporte mayor de proantocianidinas, ácidos fenólicos y estilbenos al mosto durante la vinificación. Por otra parte, la mayor concentración de compuestos fenólicos en los vinos de VN21 también podría estar relacionada con una mayor extractabilidad del hollejo que haya favorecido una mayor solubilización y transferencia de estos compuestos al mosto.

Esta mayor extractabilidad puede deberse en parte a un estado más avanzado de madurez de VN21 en el momento de la vendimia que se traduce en un mayor contenido de azúcares. Sin embargo, si observamos la evolución de la concentración de alcohol durante la fermentación alcohólica, podemos observar que entre los días 2-3 de fermentación el contenido de alcohol es muy similar en los mostos de ambos clones (Figura 3A), por lo que el incremento en la concentración de todos los compuestos fenólicos entre los días 2-3 de fermentación no se explica por un mayor contenido de alcohol en los mostos de VN21. Otra explicación plausible, puede ser la ausencia de ceras en el hollejo de VN21 que podría favorecer el contacto entre el hollejo y el mosto mejorando la solubilización de compuestos fenólicos altamente hidrosolubles.

Este trabajo pone de manifiesto la variación somática que puede existir entre distintos clones y accesiones de una variedad en lo relativo a la composición fenólica del vino, así como la utilidad del análisis metabolómico para su caracterización y seguimiento en los procesos de selección clonal de vid. Estas herramientas pueden permitir la identificación de nuevas variantes espontáneas, como es el caso de este Tempranillo negro, con mejores cualidades enológicas que permitan obtener vinos más singulares en cuanto a color, características organolépticas y mayor aporte de compuestos fenólicos en la dieta, a través de un consumo moderado de vino en el contexto de una dieta mediterránea.

Este estudio ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (cofinanciado por Fondos Social Europeo, Unión Europea) con el proyecto BIO2017-86375-R; una beca del Gobierno de La Rioja; y la financiación parcial de “Ayudas de incorporación a escalas científicas CSIC, 2018” (Referencia 201870I129).

Referencias bibliográficas

• He F, Liang N-N, Mu L, Pan Q-H, Wang J, Reeves MJ, Duan C-Q. 2012. Anthocyanins and their variation in red wines I. Monomeric anthocyanins and their color expression. Molecules (Basel, Switzerland) 17, 1571-1601.
• Hornedo-Ortega R, González-Centeno MR, Chira K, Jourdes M, Teissedre P-L. 2020. Phenolic compounds of grapes and wines: Key compounds and implications in sensory perception. Chemistry and Biochemistry of Winemaking, Wine Stabilization and Aging: IntechOpen.
• Ibáñez J, Carreño J, Yuste J, Martínez-Zapater JM. 2015. 9 - Grapevine breeding and clonal selection programmes in Spain. In: Reynolds A, ed. Grapevine Breeding Programs for the Wine Industry. Oxford: Woodhead Publishing, 183-209.
• Royo C, Ferradás Y, Martínez-Zapater JM, Motilva MJ. 2021. Characterization of Tempranillo negro (VN21), a high phenolic content grapevine Tempranillo clone, through UHPLC-QqQ-MS/MS polyphenol profiling. Food Chem 360, 130049. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814621010554