Causas y orígenes de la contaminación del vino por Haloanisoles

El sabor y/o aroma a moho o a humedad del vino es consecuencia de la presencia en el ambiente de microorganismos (especialmente hongos filamentosos), los cuales al entrar en contacto con una serie de pesticidas de alta toxicidad utilizados industrialmente (halofenoles), desarrollan una reacción de defensa que les lleva a producir haloanisoles. Estos pesticidas son los clorofenoles, fluorofenoles, yodofenoles y bromofenoles.

Los haloanisoles son contaminantes muy importantes capaces de arruinar las propiedades organolépticas naturales de cualquier vino. Sus características más importantes son que producen desagradables olores denominados como fúngicos o a moho (olores mohosos) o como olores y aromas propios de humedad, tienen un umbral de percepción olfativa muy bajo (del orden de ng/l), generalmente son muy volátiles, capaces de transmitirse a través del aire y con una gran facilidad para adherirse y contaminar la madera, el corcho y también otros materiales (polímeros plásticos, siliconas, cartón y papel, gomas, resinas, etc.).

Los haloanisoles (cloroanisoles y bromoanisoles) reconocidos como los enemigos declarados del vino más importantes son el 2,4,6-tricloroanisol (2,4,6-TCA), el 2,3,4,6-tetracloroanisol (2,3,4,6-TeCA), el pentacloroanisol (PCA) y el 2,4,6- tribromoanisol (2,4,6-TBA). Estructuralmente son compuestos derivados del anisol o metoxibenceno, e incluyen en su composición uno o más átomos de un halógeno. El anisol es un compuesto presente en un gran número de sustancias volátiles que suelen ser muy olorosas, mientras que los halógenos son cuatro: flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) y yodo (I). Por eso los anisoles que resultan de su interacción son llamados fluoroanisoles, cloroanisoles, bromoanisoles y yodoanisoles.

Desde un punto de vista biológico, los haloanisoles se originan por una reacción bioquímica de defensa conocida como biometilación que tiene lugar en determinados microorganismos (fundamentalmente hongos filamentosos). Ante una agresión externa de los halofenoles (pesticidas muy tóxicos), el hongo es capaz de transformarlos en haloanisoles no tóxicos.

La formación de haloanisoles es, por tanto, un mecanismo de supervivencia para muchos microorganismos (hongos y bacterias) cuando entran en contacto con halofenoles tóxicos.

Los halofenoles más ampliamente utilizados por el hombre son los clorofenoles y los bromofenoles. Estos compuestos se transforman en anisoles por la acción biológica de determinados microorganismos, fundamentalmente hongos filamentosos (como una cepa de Trichoderma longibrachiatum aislada a partir de corcho en nuestro laboratorio) capaces de llevar a cabo reacciones químicas (Coque et al., 2003).

Los clorofenoles no son sustancias creadas por la naturaleza, sino que han sido producidos artificialmente por el hombre. Por eso, apenas existen microorganismos capaces de degradarlos por lo que son compuestos muy recalcitrantes: persisten de forma tenaz en la naturaleza durante periodos de tiempo considerables (hasta decenios).

Algunos autores apuntan a que los clorofenoles podrían formarse además durante el proceso de cloración del agua mediante reacción del hipoclorito sódico con fenoles disueltos en ella (Nystrom et al., 1992), mientras que también se ha sugerido que en el corcho podría formarse durante el blanqueo de los tapones con lejía (práctica hoy ya en desuso).

Los clorofenoles, especialmente el pentaclorofenol (PCP) y el 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP) son dos de los pesticidas más ampliamente utilizados. Además las preparaciones de PCP suelen estar contaminadas con un 2-8% de 2,3,4,6- tetraclorofenol (2,3,4,6-TeCP).

Su amplio uso se debe a que son muy fáciles de sintetizar para las industrias químicas, son muy baratos, liposolubles (solubles en grasas) por lo que atraviesan las membranas de los seres vivos y son muy tóxicos. La toxicidad se debe a su capacidad para reaccionar y destruir las proteínas y el material genético o ADN de los seres vivos.

Los clorofenoles han sido ampliamente utilizados durante décadas como pesticidas (antifúngicos) y preservantes de la madera, tanto en agricultura como en la industria, para evitar el crecimiento de hongos sobre madera, embalajes (cartón) y pieles, y en menor medida en granos (cereales) y cultivos. Como consecuencia han llegado a ser uno de los grupos más importantes de contaminantes que pueden ser hallados en prácticamente cualquier ecosistema (Chaudhry y Chapalamadugu, 1991).

El empleo de clorofenoles está actualmente prohibido en Europa ya que se sospecha que son cancerígenos. Sin embargo, continúan siendo ampliamente utilizados en países en desarrollo (Asia y África principalmente).

A la vista de estos datos podemos afirmar que las posibles contaminaciones que afectan al sector del vino se pueden producir a dos niveles:

• Contaminaciones del corcho producidas directamente en el bosque de alcornoques por exposición a clorofenoles, o contaminación del corcho durante el proceso de manufactura del tapón en la industria corchera.
• Contaminación del vino, o del tapón, durante su almacenaje en la propia bodega generalmente por contaminación de la madera de estructuras (techos y paredes), toneles y barricas o estantes donde reposan las botellas.

Los bromofenoles son, tras los clorofenoles, los compuestos más ampliamente utilizados, especialmente el 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBP). Este compuesto se puede encontrar de manera natural en ambientes marinos ya que es sintetizado por algunas algas pardas como una manera de eliminar un exceso de bromo (Flodin y Whitfield, 1999). La aparición de bromofenoles y bromoanisoles en el vino está en relación directa con su presencia en bodegas (Chatonnet, 2004) a donde podrían llegar a través de pinturas, barnices y maderas tratadas.

Los estudios realizados por nuestro grupo de investigación al respecto nos han permitido obtener varias conclusiones importantes (referencias Álvarez-Rodríguez et al., 2002a y 2004 y Coque et al., 2003).

1. El único mecanismo efectivo para explicar la formación de cloroanisoles a niveles apreciables, tanto en bodega como en corcho, es la transformación del pesticida 2,4,6-TCP por biometilación en 2,4,6-TCA (ver reacción química en figura 4).
2. Este pesticida puede contaminar tanto las planchas de corcho en las fábricas, como los palés y estanterías de madera en las bodegas, y es transformado a 2,4,6-TCA por una amplia variedad de microorganismos, principalmente hongos filamentosos.
3. Esta transformación es llevada a cabo por aquellos microorganismos que poseen una proteína (enzima) llamada clorofenol O-metiltransferasa (CPOMT) que puede metilar una amplia variedad de clorofenoles para sintetizar los correspondientes cloroanisoles.
4. Una única enzima, la CPOMT, es responsable de la síntesis de todos los anisoles que afectan al vino: 2,4,6-TCA, 2,3,4,6-TeCA, PCA y 2,4,6-TBA.

Hoy está totalmente demostrado que los hongos filamentosos naturales sólo sintetizan cloroanisoles cuando entran en contacto con clorofenoles. Los clorofenoles se encuentran actualmente como contaminantes de aguas, suelos, material vegetal (como hojarasca de bosques) e incluso la atmósfera. La razón de ello es su uso y producción indiscriminada durante los últimos decenios a razón de varios millones de toneladas anuales. Esto, unido a su elevada resistencia a su biodegradación ambiental, ha producido su acumulación en todos los ecosistemas que se analizan.

Debido a su elevada toxicidad, precisamente por eso se usan como fungicidas y pesticidas, cuando un hongo filamentoso entra en contacto con los clorofenoles intenta por todos los medios su inactivación (destoxificación o eliminación de su toxicidad) ya que en caso contrario podría morir o sufrir daños importantes que afecten a su fisiología.

Para ello los hongos han desarrollado dos estrategias diferentes:

• I) Cuando un hongo filamentoso entra en contacto con el 2,4,6-TCP como mecanismo de defensa produce enzimas tipo lacasas que son secretadas al exterior de la célula para degradar allí los clorofenoles, evitando que entren en la célula donde pueden dañar al hongo filamentoso.
• II) Sin embargo, los clorofenoles son compuestos liposolubles que pueden llegar a atravesar la pared y la membrana celular del hongo para alcanzar su interior (citoplasma y núcleo) donde pueden dañar irreversiblemente proteínas importantes, o incluso su material genético (ADN). Ante esta amenaza el hongo se defiende produciendo inmediatamente la enzima CPOMT (Clorofenol O-metiltransferasa), descubierta en nuestro laboratorio, y que es la responsable de transformar el 2,4,6-TCP tóxico, en un compuesto inofensivo, el 2,4,6-TCA. Éste es expulsado de la célula y así el 2,4,6-TCA pasa directamente y se adhiere al corcho, la madera o cualquier otro material sobre el que el hongo está creciendo, puesto que el mecanismo es el mismo en todos los casos.

Esta estrategia de defensa es muy común entre los hongos filamentosos, de manera que la mayor parte de los hongos, presentes tanto en corcho como en bodegas, pueden sintetizar anisoles. Además en nuestro laboratorio hemos demostrado que esta enzima puede actuar sobre distintos clorofenoles y bromofenoles. Por tanto, la enzima CPOMT es la responsable de la formación de todos los anisoles (cloroanisoles y bromoanisoles) que contaminan el vino.

Los datos científicos expuestos demuestran que el verdadero origen de la contaminación del vino por cloroanisoles es un problema de contaminación ambiental y no del empleo de tapones de corcho defectuosos. Sin embargo, partiendo del hecho de que un número limitado de casos puede deberse al empleo de tapones defectuosos, no podemos dejar de afirmar que el enfoque, hasta ahora clásico, de culpar casi exclusivamente al tapón de corcho es demasiado simplista y requiere un análisis más riguroso, puesto que existen diferentes fuentes de contaminación. De hecho, es posible detectar en bodegas vinos contaminados que nunca han estado en contacto con corcho (Chatonnet et al., 2004).

Contaminaciones atribuibles al corcho

Varios estudios realizados indican que los tapones de corcho serían los responsables de un número significativo de casos de contaminación, aunque no existen estudios rigurosos que confirmen con veracidad el porcentaje de casos que realmente serían achacables al tapón.

Así, existe cierta confusión cuando se habla de contaminaciones atribuibles al corcho, pudiendo considerar dos situaciones claramente diferentes:

• El tapón de corcho como elemento contaminante. En este caso el tapón cuando llega a la bodega posee unos niveles de haloanisoles inaceptables. El origen de contaminación puede ser básicamente doble.
  • En ocasiones la contaminación se produciría en el propio alcornoque, cuando su corteza absorbe halofenoles que son transportados por la atmósfera o por el agua de lluvia, o bien que alcanzan de manera accidental el alcornoque.
  • En otros casos las planchas de corcho llegan limpias de haloanisoles a las fábricas corcheras. Sin embargo, el tapón producido está contaminado.
  • En este caso podemos afirmar de manera concluyente que en la fábrica existen uno o más puntos que producen la contaminación del corcho, emitiendo halofenoles y/o haloanisoles que son absorbidos por el corcho a lo largo del proceso productivo contaminando finalmente el tapón.
• El tapón de corcho como elemento transmisor de una contaminación existente en bodega. Ocasionalmente el tapón puede llegar limpio a la bodega donde se contaminaría debido a la existencia de materiales contaminados con halofenoles y/o haloanisoles en la misma. Es posible que un porcentaje elevado de contaminaciones atribuidas al corcho pertenezcan a esta categoría, siendo la bodega la principal responsable de la contaminación. Por otro lado, el análisis que podemos hacer es diferente en función del tipo de tapón:
  • Tapón natural. En el caso de tapones naturales se ha estimado que el nivel medio de contaminación es del 5,6% (Soleas et al., 2002). Sin embargo, el problema que plantean las partidas de tapón natural es que tapones de un mismo lote, e incluso de un mismo árbol, pueden presentar niveles de contaminación diferentes.
  • Tapón compuesto o aglomerado. El análisis de diferentes muestras de granulado de corcho indica que este material tiene unos niveles basales, aunque muy bajos, de contaminación (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a) que puede transmitir al vino.

Comportamiento del tapón de corcho frente a los cloroanisoles

El comportamiento del corcho frente al TCA se rige por unos principios fundamentales:

• El tapón de corcho tiene una alta capacidad para absorber cloroanisoles transmitidos por vía aérea sin que medie contacto directo con la fuente primaria de contaminación. Esta absorción es muy rápida y puede tener lugar en periodos muy cortos de tiempo (24 horas) (Barker et al., 2001).
• El tapón de corcho sólo es capaz de ceder al vino el 2,4,6-TCA presente en aquellas superficies que entran en contacto con el vino (Pollnitz et al., 1996; Capone et al., 1999 y 2002). Si la contaminación se localiza en la parte interna o central del corcho ésta no va a pasar al vino. Algunos estudios indican que el porcentaje medio de 2,4,6-TCA que un tapón de corcho cede al vino tras un periodo de 12 meses en botella no supera el 12%.
• El tapón de corcho puede absorber de manera muy rápida la mayor parte de los cloroanisoles presentes en un vino que esté contaminado previamente al embotellado. El 80% del TCA se absorbe durante las primeras 24 horas y el nivel de absorción aumenta hasta el 90% a las 48 horas de contacto (Capone et al., 1999) quedando el vino prácticamente libre de cloroanisoles.
• Este estudio es muy importante porque sugiere que cuando se detecta un tapón de corcho contaminado que ha estado en contacto con un vino pudiera ocurrir que la contaminación primaria fuese del vino y no del corcho. La única manera de saber si la contaminación proviene del vino o del tapón es realizar un extenso análisis de vinos y tapones contaminados. Si no existe una relación directa entre las cantidades de 2,4,6-TCA detectadas en el tapón y el vino, la contaminación sería atribuible al corcho. Si por el contrario, los tapones y el vino están contaminados de manera uniforme la fuente primaria de contaminación sería el vino.
• Esta absorción se produce sólo en los 2 mm externos del tapón de corcho, no penetrando el 2,4,6-TCA hacia el interior del tapón (Barker et al., 2001).
• El contenido de 2,4,6-TCA de un tapón puede ser uniforme y entonces la contaminación habría sucedido a lo largo de un periodo de tiempo muy largo en el árbol, o por el contrario puede concentrarse en la parte más externa del tapón (Howland et al., 1997). En este caso la contaminación habría ocurrido en algún momento posterior a la extracción del tapón de la plancha de corcho, bien sea en la fábrica de tapones o en la bodega (presumiblemente durante su almacenamiento).
• La adición de 2,4,6-TCA en la parte externa de un tapón de corcho utilizado como cierre de una botella de vino no produjo la contaminación del vino después de 3 años, lo cual sugiere que el tapón de corcho no permite el paso de 2,4,6-TCA al interior de la botella y por tanto representa una barrera efectiva para la contaminación de vino por un TCA exógeno (Capone et al., 2002).

Conjuntamente todos estos datos indican que cuando se detecta un vino cerrado con tapón de corcho y contaminado con haloanisoles no podemos afirmar, sin ninguna duda, que la fuente primaria de contaminación sea el corcho. Para hacerlo, serían necesarios análisis adicionales para descartar que el problema de contaminación se debiera al vino.

Contaminaciones de vinos no atribuibles al corcho: contaminaciones previas al embotellado

Existen varios ejemplos de vinos contaminados que no han entrado en contacto con el corcho, por lo que se trata de casos donde la contaminación tiene lugar en las bodegas. Entre ellos podemos citar los casos en los que la contaminación se ha producido a través del aire, de las barricas, del recubrimiento de madera de la bodega o la pintura que recubre las paredes.

Así pues, por todo lo expuesto podemos afirmar que hoy en día el tapón de corcho sigue siendo la mejor opción para cerrar botellas de cualquier tipo de vino. Para acabar con este problema se requiere una acción conjunta tanto de las empresas fabricantes de tapones como de las bodegas. Estas últimas deberían realizar una labor preventiva mediante análisis periódicos y exigir a los fabricantes de elementos en contacto con el vino certificados que prueben que están libres de compuestos.