Cambios en el transcriptoma de frutos de naranja Navelate en respuesta a estrés hídrico generado por cambios bruscos de humedad durante la poscosecha
P. Romero (Investigador Contratado), M. T. Lafuente (Investigador Científico CSIC) y F. Alférez (Investigador Contratado Ramón y Cajal)
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC)15/12/2014
El estrés por rehidratación durante la postcosecha causa la alteración conocida como colapso de la corteza (CC) en cítricos. Para estudiar los cambios en expresión génica global en la piel del fruto en condiciones de rehidratación diseñamos micromatrices en las que se incluyeron los 46147 ESTs descritos en la base de datos ‘citrusgenomedb.org’. La micromatriz se hibridó con muestras de cDNA de flavedo de frutos rehidratados después de haber sufrido estrés hídrico severo (condición que potencia el CC) y de sus respectivos controles mantenidos a baja (30%) o alta (90%) HR y 20 ºC durante un periodo (8 días) que apenas provocó CC. El análisis de los resultados mostró que la rehidratación favoreció procesos del metabolismo primario como la respuesta a fructosa y reprimió otros como la respuesta a deshidratación, a ABA y giberelinas, entre otros. Además, se comprobó una alteración en el catabolismo de lípidos, pared celular, metabolismo secundario y en la expresión de genes relacionados con la generación y detoxificación de especies reactivas de oxígeno y con la señalización de etileno.
Introducción
El estrés hídrico es el principal agente ambiental implicado en la pérdida de calidad de muchos frutos durante la postcosecha y su relevancia como tal se está incrementando en los últimos años conforme el cambio climático se hace más evidente. En cítricos, el estrés hídrico en el campo y durante la manipulación postcosecha causa importantes pérdidas relacionadas con el rendimiento de las cosechas y con la aparición de desórdenes fisiológicos que deprecian la calidad externa el fruto. Estos desórdenes fisiológicos aparecen en prácticamente todas las áreas citrícolas del mundo e incluyen 'stem-end rind breakdown' (SERB), debido a la deshidratación prolongada (Albrigo, 1972) y colapso de la corteza (CC), debido a cambios en la humedad relativa (HR) ambiental durante la manipulación postcosecha (Alferez et al., 2003). Estos problemas, y en especial el CC, se están haciendo cada vez más comunes debido a una combinación de factores que incluyen períodos más prolongados de sequía en el campo, distancias cada vez mayores en el transporte hasta las plantas de procesado y mayores tiempos de espera de la fruta antes de pasar por la línea de confección (Romero et al., 2013). De hecho, aunque las condiciones climáticas generales en las diferentes zonas citrícolas difieren, existen elementos comunes en todas ellas. Cuando comparamos las condiciones climáticas de la Comunidad Valenciana, Florida y la zona de clima mediterráneo semiárido de Suráfrica vemos un patrón similar en la evolución de la HR ambiental durante la temporada de cosecha de las variedades más susceptibles a desarrollar CC. Así, en la Comunidad Valenciana la alteración es más prevalente tras varios días de viento seco de poniente, seguido de viento húmedo del mediterráneo, condiciones muy frecuentes en Enero y Febrero, que coinciden con el final de la campaña de naranjas Navelina y principio de la campaña de Navelate. Estas condiciones de amplitud en la HR ambiental entre día y noche también se observan a finales de otoño y principios de invierno en Florida, coincidiendo con la campaña de la mandarina Fallglo.
Finalmente, en la región más meridional de Suráfrica, de clima mediterráneo, también se observan condiciones de HR ambiental similares en los meses de Agosto y Septiembre (finales del invierno austral) lo que provoca la susceptibilidad de una variedad tardía como la naranja Valencia. El CC se caracteriza por áreas del flavedo deprimidas, que pueden afectar o no las glándulas de aceite, pardeamientos y necrosis, todo lo cual deprecia el valor comercial de estos frutos (Fig. 1). En trabajos previos se ha mostrado de forma experimental que un factor determinante del CC es el estrés por rehidratación (Alferez et al., 2003), de forma que cuanto más se deshidrata un fruto antes de ser procesado, mayor es el daño que se induce en la piel al procesarlo (lavado y encerado) durante la postcosecha (Alferez et al., 2005). Asimismo, el procesado inmediato de los frutos antes de que la deshidratación haya sido muy pronunciada, evita, en gran medida, los síntomas de CC durante la postcosecha. A pesar de los avances realizados en los últimos años en la comprensión de las causas que originan el CC y de que se ha establecido la alteración de la HR durante la manipulación postcosecha como una de sus causas fundamentales, no se conocen en detalle las respuestas globales a nivel transcripcional y metabólico a este estrés por rehidratación, que difiere de la deshidratación, así como tampoco se conoce cómo la respuesta de albedo y flavedo a este tipo de estrés deriva en el daño en la piel. En este trabajo hemos estudiado los cambios en expresión génica global en la piel de frutos rehidratados después de haber sufrido estrés hídrico severo y de sus respectivos controles mantenidos a baja (30%) o alta (90%) HR y 20 °C durante un periodo de almacenamiento prolongado. Para ello hemos diseñado una micromatriz en la que se incluyeron los 46147 ESTs descritos en la base de datos ‘citrusgenomedb.org’. Los datos se han analizado y visualizado mediante las herramientas bioinformáticas FatiGO+ y MAPMAN, lo que nos ha permitido identificar aquellos procesos biológicos involucrados en la respuesta a las condiciones ensayadas y los cambios que tienen lugar en los frutos sometidos a rehidratación tras el estrés hídrico prolongado.
Figura 1: Colapso de la corteza (CC) en frutos de de naranja Navelina (izq.) y mandarina Fallglo (dcha.).
Material y métodos
Los frutos maduros de la variedad Navelate (C.sinensis L. Osbeck) se cosecharon de una parcela comercial en Lliria, Valencia. Los frutos estaban libres de defectos en la piel y se transportaron inmediatamente al laboratorio, donde se dividieron en 3 réplicas de lotes duplicados (uno para evaluación de CC y otro para obtención de muestras de flavedo) de 30 y se sometieron a los siguientes tratamientos: frutos mantenidos durante 8 d a 30% HR; frutos mantenidos durante 8 d al 90% HR; frutos mantenidos 4 d a 30% HR y transferidos a 90% HR 4 d más. La temperatura de almacenamiento fue de 20°C. A intervalos regulares se evaluó el índice de daños en la piel y la pérdida de peso en los frutos como ya se ha descrito anteriormente (Alferez et al., 2003). Además se aislaron muestras de flavedo, se congelaron en N2 líquido y se almacenaron para su posterior análisis. En colaboración con la compañía Bioarray se diseñó, con tecnología Agilent, una micromatriz personalizada de cítricos en la que se incluyeron los 46147 ESTs descritos en la base de datos ‘citrusgenomedb.org’ recientemente publicada. La micromatriz se hibridó con muestras de cDNA de flavedo de frutos rehidratados después de haber sufrido estrés hídrico severo (4d 30% +4d 90% HR), y de sus respectivos controles a alta (90%) y baja (30%) HR.
Resultados y discusión
Los resultados de la hibridación muestran un total de 1.528 genes expresados diferencialmente en los frutos almacenados 8 días al 30% HR con respecto a los frutos recién cosechados (Fig. 2). De éstos, un 27,48% (420 genes) se sobreexpresaron en esta condición mientras que un 72,52% (1.108) estuvieron infrarrepresentados. Por otra parte, el número de genes expresados diferencialmente en frutos transferidos al 90 % HR después de haber sido sometidos a un estrés hídrico severo (4d 30 % HR+ 4d 90 % HR) fue similar (1.489). En esta condición también predomina la represión (987 genes reprimidos frente a 502 inducidos). Al comparar los genes diferenciales en ambas condiciones sólo 182 se indujeron en ambos casos mientras que aproximadamente el 43% (650) se reprimieron.
Figura 2: Diagrama de Venn que muestra el número de genes inducidos (negrita) o reprimidos (cursiva) en respuesta al estrés hídrico severo (30 % HR) y a la rehidratación de frutos previamente sometidos a deshidratación (4d 30% HR + 4d 90% HR). Las comparaciones se realizaron con respecto a los frutos recién cosechados (FH).
Estos resultados indican que aunque la rehidratación de frutos previamente deshidratados puede modular mecanismos moleculares comunes a los que se producen como consecuencia de una deshidratación severa, también modula otros que se producen exclusivamente en esta condición de cambio de HR y el número de genes que se expresan diferencialmente de forma exclusiva en cada condición predomina sobre los comunes a ambas condiciones (Fig. 2). El análisis bioinformático (FatiGO+) nos permitió comparar los procesos biológicos infra o sobrerrepresentados en los frutos sometidos a deshidratación constante y severa con respecto a aquellos que se han rehidratado (Tabla 1). De estos resultados, junto con los derivados de la visualización, utilizando el programa MAPMAN, de los cambios metabólicos que tienen lugar al rehidratar los frutos, destacan los cambios relacionados con la modificación y catabolismo de lípidos, la pared celular, el metabolismo secundario y con la expresión de genes relacionados con la generación y detoxificación de especies reactivas de oxígeno (ROS) cuando se produce un cambio brusco de humedad. Además, los resultados pusieron de manifiesto la relevancia de los mecanismos de señalización de etileno y de respuesta a las hormonas ABA y ácido giberélico. Sólo la rehidratación favoreció procesos del metabolismo primario como la respuesta a fructosa y reprimió otros como la respuesta a falta de agua, a estímulos generados por las hormonas ácido abscísico (ABA) y giberelinas, el transporte de ácidos carboxílicos y de proteínas intracelulares y otros procesos relacionados con la biosíntesis de glucógeno y la fotosíntesis. Estos procesos podrían jugar un papel clave en el desarrollo del CC ya que la alteración aumenta 3,4 veces en solo 4 días al transferir los frutos de baja a alta HR, mientras que este incremento fue de 1,7 veces cuando los frutos se mantuvieron al 30% de HR (datos no mostrados). La comparación de estos resultados con otros previos obtenidos al analizar el efecto de la deshidratación moderada en un mutante deficiente en ABA muy susceptible a la deshidratación y al CC (Romero et al., 2012) indica que el daño causado por la rehidratación puede estar relacionado con la falta de capacidad de los frutos rehidratados, después de sufrir un estrés hídrico, para generar respuestas de defensa al estrés hídrico.
Tabla 1: Procesos biológicos infra- (↓) o sobre- (↑) representados en frutos sometidos al estrés hídrico severo (30% HR) y a la rehidratación de frutos previamente sometidos a deshidratación (4d 30% HR + 4d 90% HR).
De este modo, queremos hacer hincapié en que sólo el estrés por rehidratación, que potencia el CC, disminuyó la capacidad de los frutos para responder a la falta de agua, o a las hormonas ABA y giberelinas. Además, sólo en los frutos sometidos a cambios bruscos de humedad no aparecen sobrerrepresentados procesos relacionados con la señalización de etileno, que protege a los frutos cítricos frente al CC (Lafuente y Sala, 2002). Finalmente, y teniendo en cuenta los procesos diferenciales que se producen específicamente en los frutos rehidratados tras la deshidratación, cabe destacar que tanto el transporte de ácidos dicarboxílicos como el metabolismo de péptidos y de oxilipinas pueden estar implicados en la susceptibilidad de los frutos cítricos a desarrollar el CC cuando se someten a un cambio brusco de humedad relativa durante la postcosecha.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido subvencionado por los proyectos AGL2009-11969 (CICYT) y PROMETEO/2010/010 (Generalitat Valenciana). F.A. disfruta de un contrato Ramón y Cajal (MICINN y Fondo Social Europeo).
Referencias bibliográficas
Albrigo, G. 1972. Distribution of stomata and epicuticular wax on oranges as related to stem end rind breakdown and water loss. Journal of the American Society for Horticultural Science 97, 220-223.
Alférez F, Agustí M, Zacarías L. 2003. Postharvest rind staining in Navel oranges is aggravated by changes in storage relative humidity: effect on respiration, ethylene production and water potential. Postharvest Biology and Technology 28, 143-152.
Alférez F, Zacarías L., Burns, J. 2005. Low relative humidity at harvest and before storage at high humidity influence the severity of postharvest peel pitting in Citrus fruit. Journal of the American Society for Horticultural Science, 130: 225-231.
Lafuente M.T., Sala, J. M. 2002. Abscisic acid levels and the influence of ethylene, humidity and storage temperature in the incidence of postharvest rindstaining of ‘Navelina’ orange (Citrus sinensis L.Osbeck) fruits. Postharvest Biology and Technology. 125: 49-57
Romero P, Rodrigo MJ, Alférez F, Ballester AR, González-Candelas L, Zacarías L, Lafuente MT. 2012. Unravelling molecular responses to moderate dehydration in harvested fruit of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) using a fruit-specific ABA-deficient mutant. Journal of Experimental Botany. 63, 2753-2767.
Romero P, Gandía M, Alférez F. 2013. Interplay between ABA and phospholipases A2 and D in the response of citrus fruit to postharvest dehydration. Plant Physiology and Biochemistry 70, 287-294.
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“El programa IFM es en la actualidad un concepto, una ideología, obtenida a partir de la analogía con el concepto IPM pero aplicado al control de las fisiopatías (alteraciones) en poscosecha”
