Control analítico de la fermentación maloláctica

La FML es llevada a cabo por bacterias lácticas usualmente pertenecientes a los géneros Oenococcus, Lactobacillus y Pediococcus, siendo Oenococcus Oeni la especie principalmente involucrada en este proceso. Estos microorganismos están presentes naturalmente en la uva y, por tanto, en el vino producido, y pueden adaptar su desarrollo a las condiciones imperantes al final de la fermentación alcohólica (10% etanol y pH entre 3 y 4). Por tanto, podemos concluir que, si se dan las condiciones, la FML puede realizarse de manera espontánea. Por otro lado, una gran parte de enólogos prefieren inducir la maloláctica de manera controlada utilizando preparados comerciales. Para favorecer este proceso se suelen ajustar las condiciones del vino, como la temperatura y el pH, para proporcionar un entorno adecuado para el crecimiento y la actividad de las bacterias del ácido láctico. El agregado externo de los microorganismos se emplea cuando se desea controlar la producción de aromas deseados y evitar los indeseables.

A nivel químico, el principal resultado de la FML es la eliminación de un ácido más fuerte (el málico) por uno más débil (el láctico). Esto se debe a dos factores. En primer lugar, el ácido málico es diprótico mientras que el ácido láctico es monoprótico, es decir, hay más funciones ácidas en el málico. En segundo lugar, a temperatura ambiente, la pKa (el logaritmo matemático negativo de la constante de disociación de un ácido) del málico es menor a la del láctico (3,45 vs. 3,86), lo cual significa que se disocia más en solución. Por tanto, el efecto del ácido málico sobre la acidez y el pH será mayor que el del ácido láctico cuando están presentes en la misma concentración. Dicho de otra manera, cabe esperar que un vino que haya pasado por un proceso de FML tenga un pH mayor y una acidez menor.

Sin embargo, no todo queda en una regulación de la acidez. Además de mejorar este punto, con lo que se logra una sensación de redondez en boca, la FML conlleva un cambio en los perfiles aromáticos de los vinos. Mientras que el ácido málico aporta aromas a manzana verde y herbáceos, el ácido láctico y los compuestos generados durante la FML (ésteres, aldehídos, entre otros) aportan un universo complejo de aromas entre los cuales están las notas a mantequilla, a bollería, a frutos secos y tonos tostados y ahumados. En consecuencia, un vino que haya pasado por la FML tendrá mayor untuosidad y complejidad y será más redondo en boca.

La FML también aporta otros beneficios al vino, entre los cuales se pueden resaltar:

• Un ligero aumento del pH (del orden de 0,1-0,3 unidades), que provoca también una modificación del color del vino tinto, debido a que los antocianos evolucionan a tonalidades menos intensas y menos rojas.
• La producción de polisacáridos, que se unen a los taninos y reducen la astringencia.
• La producción de manoproteínas, que aportan sensación grasa y volumen en boca.
• Una mayor estabilidad microbiológica del vino frente a otros microorganismos debido al consumo de los azúcares y del ácido málico.

El uso de la FML no sólo aporta beneficios, sino que también conlleva algunos riesgos a la hora de la vinificación. Por un lado, se podría dar el caso del picado láctico, que ocurre cuando existe una importante producción de ácido láctico y acético por parte de las bacterias lácticas a partir de los azúcares residuales de la fermentación. Este caso es fácil de detectar porque se produce el isómero D-láctico en lugar del L-láctico típicamente relacionado a la FML. Por otra parte, algunas bacterias lácticas, mayoritariamente contaminantes, pueden llegar a producir cantidades considerables de aminas biógenas como la histamina, la putrescina y la cadaverina, entre otras. Por encima de ciertos umbrales de concentración este grupo de aminas está relacionado con la aparición de cuadros tóxicos en las personas.

Considerando los efectos de la FML, cabe decir que este proceso no es regla general para todos los vinos. En la gran mayoría de los vinos tintos se realiza la FML para obtener un vino con mejor cuerpo, más redondo y con mejores condiciones para su crianza. Sin embargo, en los vinos blancos y rosados se evita la FML para así mantener sus condiciones naturales de acidez y frescura. Lo mismo sucede con los vinos bases en la producción de espumosos. Como excepción a la regla, existen vinos blancos a los cuales se les facilita la FML como los Chardonnay con paso por barrica, donde se buscan perfiles aromáticos relacionados con la producción de diacetilo, o vinos de regiones frías donde se lleva a cabo la maloláctica con el objetivo de reducir la acidez. Por el contrario, en un vino tinto de regiones cálidas (con baja acidez natural) es posible que se requiera inhibir la FML para evitar el desequilibrio que generaría.

En resumen, la fermentación maloláctica es un proceso importante en la producción de buena parte de los vinos, pero también de otras bebidas alcohólicas (como la sidra y la cerveza), porque ayuda a suavizar la acidez del vino y contribuye a su complejidad aromática, mejorando su calidad y sabor.

Por otra parte, no es una técnica que se pueda aplicar de forma generalizada a todos los vinos, por lo cual en ciertos casos se busca su inhibición. Al respecto, existen una gran diversidad de prácticas aprobadas por la Organización Internacional del Vino y la Viña (OIV). Algunas técnicas físicas incluyen el control de la temperatura, el control del pH y la filtración para eliminar bacterias antes del embotellado. Respecto a las técnicas de control químico, la más empleada de todas es el uso del SO2 como agente antimicrobiano. Sin embargo, la creciente preocupación por su clasificación como alérgeno y los límites legales imperantes han desalentado su uso frente a otras técnicas más novedosas como la utilización de lisozimas, de quitosano o de ácido fumárico (de reciente aprobación por la OIV) como inhibidores de la FML.

Sea porque se quiera favorecer o porque se desea inhibir la FML es fácil llegar a la conclusión que, en ambos casos, será necesario mantener un estricto control analítico y monitoreo del proceso, a fin de evitar resultados indeseados durante la vinificación.

El primer control para llevar a cabo una FML exitosa es el de las condiciones previas a la misma. Es necesario entender que si se va a llevar a cabo una inoculación de bacterias lácticas habrá que ajustar ciertos parámetros del vino de manera que sean favorables al desarrollo de los microorganismos deseados. Entre estos parámetros se encuentran la temperatura (debería estar entre 18-22 °C), el pH (que debería rondar entre 3,3-3,5), el nivel de alcohol (que no ha de superar el 14%) y el contenido en SO2 Total (que no tendría que sobrepasar los 30 mg/L).

Ya con la FML en marcha, su control se puede realizar por diversas técnicas que se encargan de monitorear la concentración de ácido málico y/o del ácido láctico, entre ellas:

• Cromatografía en papel.
• Cromatografía de capa fina.
• Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
• Análisis enzimático.
• Análisis por infrarrojo (FTIR).

A continuación, se explican los fundamentos de cada técnica junto a las ventajas e inconvenientes que presentan.

Cromatografía en papel

Es el método más simple de todos. Requiere del uso de unos tubos capilares de vidrio para tomar la muestra y depositarla sobre un papel, que luego se colocará en un recipiente con el solvente y un indicador por unas 4-6 horas. Una vez que se retira el papel y se deja secar (aproximadamente 1 día), aparecerán una serie de manchas que denotarán la presencia de uno o más ácidos típicamente encontrados en el vino (tartárico, cítrico, málico, láctico). La distancia recorrida desde la base del papel hasta la mancha es el indicativo del tipo de ácido del que se trata.

Es un método muy económico y relativamente sencillo de efectuar por cualquier operario. Sólo es necesario tener en cuenta la toxicidad y el descarte del solvente orgánico utilizado para la cromatografía.

Sin embargo, la principal desventaja es que es un método de tipo cuantitativo: detecta la presencia o no del ácido de interés, pero no aporta información alguna sobre su concentración. Si se tiene en cuenta que el límite de detección para el ácido málico en este tipo de técnica es de alrededor de 100 mg/L, es fácil ver que se aleja de los 30 mg/L que se suelen considerar como un final seguro de la FML. Este ácido málico residual podría generar una FML espontánea en la botella con todos los problemas que esto acarrea (pérdida de color, turbidez, modificación del aroma, liberación de CO₂, etc.).

A pesar de este inconveniente, es una técnica sencilla y al alcance de todos los laboratorios para observar el inicio de la FML, aunque no tanto para su monitoreo.

Cromatografía de capa fina

Si bien el principio de funcionamiento es similar a la anterior técnica, la principal diferencia radica en la utilización de unas placas de sílice que le aportan mayor velocidad al método. Los tiempos de la cromatografía se pueden reducir a unos 15 minutos y el secado es mucho más rápido. Por el contrario, el tipo de solvente requerido en esta técnica precisa de un laboratorio que cuente con un sistema de extracción para cumplir así con las cuestiones relativas a la higiene y seguridad en el trabajo.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Es una técnica altamente precisa, fácilmente automatizable y relativamente rápida para el análisis de diversos tipos de compuestos del vino, entre ellos los ácidos. Sin embargo, la gran desventaja es la alta inversión inicial y la complejidad de su operación. Además del equipamiento en sí y de la columna adaptada al tipo de determinación, se requerirán viales de muestras, solventes especiales y sistemas de filtración adecuados.

Todo esto hace que, a pesar de ser el método que en teoría es más preciso para la determinación del ácido málico y/o del ácido láctico, su costo lo limita a aplicaciones en laboratorios de investigación y desarrollo más que en bodegas.

Kits enzimáticos

Son reactivos que se utilizan para determinar de manera muy específica y rápida el analito de interés. Además, son el método de referencia aprobado por la OIV para la determinación del ácido málico y del ácido láctico, entre otros parámetros. En el caso particular de TDI, se han desarrollado test específicos para la determinación cuantitativa de ácido málico y ácido láctico en muestras de vinos y otras bebidas. Estos kits están compuestos por una serie de reactivos pronto al uso que contienen el tampón, el cofactor NAD, las enzimas y el resto de compuestos químicos necesarios para llevar a cabo la determinación analítica basada en las siguientes reacciones:

Para la determinación del Ácido L-Málico:

Para la determinación del Ácido L-Láctico:

Son métodos muy rápidos (10-15 minutos), muy específicos y de alta sensibilidad, pudiendo determinar valores de ácido málico muy próximos al umbral de seguridad. Es así que, en la práctica, son el método ideal para determinar de manera rápida y económica el final de la FML.

Un par de consejos prácticos para hacer un correcto seguimiento de la FML. En primer lugar, el inicio de la FML debería determinarse a través de la concentración de ácido láctico, debido a que su concentración subirá rápidamente desde un valor inicial de cero. Por el contrario, la mejor alternativa para asegurar el final de la FML es a través de la medida del ácido málico, ya que, en esta parte del proceso, el láctico prácticamente no variará en su concentración mientras que el málico irá acercándose al cero.

En lo relativo al nivel de complejidad de la técnica, cabe decir que, en caso de emplear un espectrofotómetro, se requerirá cierta destreza manual por parte del operador en la utilización de micropipetas. Sin embargo, si esta etapa es automatizada como se verá más adelante, la complejidad de la operatoria se ve sustancialmente reducida.

Desde el punto de vista económico, la utilización de los kits enzimáticos en conjunción con un espectrofotómetro manual puede llegar a ser más costosa que la cromatografía en papel. Sin embargo, la posibilidad de automatizar el proceso reduce en unas 10 veces el costo analítico, ya que permite emplear volúmenes de reactivos del orden de los cientos de microlitros.

Un analizador químico automático consta de dos partes bien diferenciadas. Por un lado, un sistema robótico de alta precisión permite la manipulación y dispensación de muestras y reactivos con volúmenes en el rango de 2-300 microlitros de forma muy precisa y repetitiva. Por el otro, el sistema fotométrico garantiza el correcto seguimiento y evaluación de la reacción enzimática, posibilitando la realización de calibraciones y la determinación de las concentraciones de interés en las muestras incógnitas. Este tipo de equipos se comercializan en distintos tamaños de manera tal que pueden adaptarse a las necesidades analíticas de prácticamente todas las bodegas. El rango más completo de analizadores químicos automáticos lo constituye la gama Miura, comercializada por TDI desde hace más de 15 años. Está compuesta por 4 analizadores: Miura Micro, Miura One, Miura 200 y Miura 200 2 brazos. Cada uno de ellos representa un nivel diferente de productividad, moviéndose en un rango que va desde los 60 hasta los 240 resultados por hora. El precio de cada uno de ellos permite que se acomode perfectamente al presupuesto de la bodega en función de la capacidad de producción y las necesidades analíticas.

Debido a que este tipo de analizadores también se puede utilizar para la determinación de una gran variedad de parámetros de importancia en el mosto y el vino (como azúcares, ácidos, SO2), no es equivocado decir que son la mejor elección a la hora de invertir en las capacidades analíticas de un laboratorio de una bodega.

Analizadores FTIR

Los analizadores por infrarrojo son otra solución para la determinación de parámetros analíticos de interés en enología. Permiten obtener los valores de concentración de diferentes compuestos a partir del espectro infrarrojo de una muestra de vino, sin consumo de reactivos químicos y con una alta velocidad de respuesta (alrededor de 30 segundos). Su precisión y exactitud están garantizadas a partir de la elaboración de calibraciones basadas en un alto número de muestras cuyos parámetros han sido determinados por métodos oficiales reconocidos por la OIV. Una vez realizadas estas calibraciones, que son entregadas por parte de TDI al cliente junto con el equipo, la operativa de rutina pasa a ser muy sencilla.

Si bien son equipos más costosos que los analizadores químicos, la inversión inicial se ve compensada a lo largo del tiempo por su flexibilidad a la hora de determinar una gran cantidad de parámetros a partir de una misma muestra, por su velocidad en la entrega de resultados y por el nulo consumo de reactivos químicos.

Por todo lo visto, representan una solución muy útil para el seguimiento de la FML, aunque a concentraciones menores de 0,4 g/L de ácido málico es recomendable realizar un análisis enzimático para determinar a ciencia cierta el final del proceso.

TDI ofrece dos soluciones FTIR según el nivel de automatización requerido, el Bacchus 3 en versión Manual y en versión Auto con un muestreador incorporado. Ambos equipos cuentan con una librería de calibraciones que, además de permitir el control de la FML, posibilitan también la determinación de una serie de parámetros de mucha importancia en la enología actual (como azúcares, ácidos, etc.).

A manera de conclusión, la tabla que se presenta a continuación muestra las ventajas y desventajas principales de cada tipo de técnica haciendo foco en cinco aspectos muy importantes: la inversión inicial, el costo analítico, la velocidad de análisis, la precisión y la complejidad de su operación.

La decisión de utilizar uno u otro método para el control de la FML dependerá no sólo de las características, ventajas y desventajas ya enumeradas, sino también de otras variables como: el presupuesto con que cuenta la bodega, los recursos humanos y materiales disponibles, el número de muestras a analizar y la posibilidad de utilizar esta técnica para la determinación de otros parámetros.

En TDI nos especializamos en la provisión de la mejor solución analítica adaptada a las necesidades y las capacidades de cada laboratorio y/o bodega. Contacte con nosotros y lo asesoramos para juntos encontrar la mejor solución.

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