Migración de métodos de HPLC a UHPLC: aplicación en el campo alimentario

Para realizar la transferencia a métodos de UHPLC el primer factor a considerar es el tipo de fase estacionaria empleado en el análisis HPLC actual. La migración más sencilla supone elegir un tipo de fase estacionaria UHPLC que sea idéntica o muy similar a la empleada en HPLC convencional, de este modo, las características de retención son similares. Para simplificar este proceso, PerkinElmer ofrece una útil herramienta diseñada para este fin (figura1), que permite introducir los parámetros de su actual método HPLC, y proporciona un método UHPLC recomendado. También proporciona información muy interesante sobre el ahorro tanto en tiempo de análisis como de ahorro de disolventes.

En este artículo, el análisis de ginsenósidos (presentes en el Ginseng) será usado como ejemplo para demostrar la facilidad de migración al UHPLC. Los ginsenósidos del Ginseng son comúnmente aislados por el tradicional HPLC usando una columna C18 y un gradiente acetonitrilo/agua.

En este estudio, la separación HPLC se llevó a cabo con una columna analítica Brownlee PerkinElmer C18, 150 mm x 4,6 mm, 5 µm. El tiempo total de análisis fue de 61 minutos, el flujo 1,5 ml/ minuto, la detección ultravioleta a una longitud de onda de 203 nanómetros, la temperatura de la columna de 30 °C y volumen de inyección de 20 µl. Los dos componentes con una resolución más crítica son Rg1 y Re, con una resolución (RS) de 1.680.

Se escogió para el análisis de UHPLC una columna analítica de PerkinElmer Brownlee C18, 50 mm x 2,1 mm, 1,9 µm. Los principales parámetros ajustados, entre HPLC y UHPLC, han sido: velocidad de flujo, volumen de inyección, tiempo de etapas isocráticas, así como el tiempo y pendiente de las etapas de gradientes.

El cromatograma UHPLC se muestra en la figura 2. Los ajustes fueron hechos sistemáticamente en velocidad de flujo, volumen de inyección, y temperatura de la columna para optimizar las condiciones UHPLC. La velocidad de flujo calculada fue 0,82 ml/minuto, pero después de una optimización se consideró que 0,7 ml/minuto era suficiente para la separación de todos los componentes.

Esto constituye un descenso de 2,1 en la velocidad de flujo comparada a las condiciones HPLC. El volumen de inyección se incrementó desde el valor calculado de 1,4 µl, a 5 µl, para maximizar la sensibilidad. Esto constituye un descenso de 4 veces en el volumen de las muestras comparado con los 20 µl de inyección del HPLC. La temperatura de la columna se incrementó de 35°C para disminuir la viscosidad de la fase móvil y la presión de trabajo. La presión máxima durante el análisis de HPLC fue ~1400 psi mientras que la presión máxima durante el análisis de UHPLC fue de ~8100 psi. El tiempo requerido para convertir este análisis a UHPLC fue inferior a un día de trabajo. Gracias a estas herramientas, el método de migración puede ser relativamente sencillo. El resultado supone un aumento en 5 veces de la productividad, debido a una reducción en los tiempos de análisis y un 91% de ahorro en el consumo de fase móvil debido a la reducción en la velocidad de flujo. Además, la sensibilidad aumenta mientras el consumo de muestras y patrones se reduce. Por todo ello, un sistema UHPLC se puede amortizar en menos de un año. Esta debería ser la razón que nos llevara a migrar al UHPLC.