Nuevas aplicaciones de la nanotecnología en la industria del vino: nanopartículas de plata como una alternativa plausible a los sulfitos

Podemos definir la nanotecnología como ‘la investigación y el desarrollo tecnológico a escala atómica, molecular o macromolecular que conduce a la creación y el uso de estructuras, dispositivos y sistemas controlados con un intervalo de longitudes comprendido entre 0,1 y 100 nanómetros (nM)’. Para dar un ejemplo de lo que esto significa, 1 nm es la longitud de una cadena de 5 a 10 átomos, y un cabello humano tiene aproximadamente 80.000 nm de diámetro. Ciertamente el nanómetro es una cantidad pequeñísima, que incluso resulta difícil de imaginar.

El principal interés de los nanomateriales se basa en nuevas propiedades físicas y químicas derivadas del pequeño tamaño de las partículas, tales como aumento de la reactividad química debido a una mayor área de superficie (aumentando de esta manera el número de átomos que se ubican en su superficie), mayor poder de penetración, y un efecto más rápido (Serena Domingo, 2010). Estas propiedades confieren diferentes efectos a los nanomateriales, y hacen de la nanotecnología, una ciencia multidisciplinar con capacidad de crear nuevos productos en muchas áreas de aplicación, y que prácticamente no deja sectores productivos que se puedan escapar de esta nueva tecnología, que promete una gran avalancha de materiales, dispositivos y productos, con el consiguiente impacto económico y social. En la actualidad, se considera que ya hay más de 1.000 productos comerciales que cuentan con componentes nanoestructurados de algún tipo. Existe, además, toda una red de empresas de base tecnológica que fabrican productos ‘nano’ o que hacen sus productos con nanotecnología. En este sentido, se puede destacar que todas las grandes industrias tienen una división de nanotecnología, en la que se han generado innovadores productos.

La aplicación de la nanotecnología en la agricultura y en la industria alimentaria, se trató por primera vez en el Departamento de Agricultura de EE UU (USDA) en septiembre de 2003. El término de ‘nanoalimentos’, que se refiere a aquellos que contienen nanopartículas, se utilizó por primera vez en 1998, por el investigador Dongmyong Kim, profesor de la Universidad Nacional de Seul y presidente de la International Nanofood Research Society. El ejemplo más claro de cómo operan las nanopartículas es la salsa kétchup. Las partículas fueron alteradas para modificar los fluidos y darle nuevas características de viscosidad. De no tener nanopartículas, al voltear el envase de cabeza, el líquido se desplomaría como leche. Hoy en día, se estima que en los supermercados circulan alrededor de 500 productos que contienen nanopartículas.

A pesar del gran avance que la tecnología está teniendo, se considera que está aún en fase de despegue en el terreno alimentario. Sus principales aplicaciones se relacionan con la conservación, envasado y empaquetado de alimentos, y especialmente en sector de envases activos y envases inteligentes, que permiten la liberación de conservantes a demanda. El procesado de alimentos, como es la gelatinización, la obtención de espumas y emulsiones, y como potenciadores del sabor y textura; por ejemplo, la utilización de nanopartículas de azúcar y/o sal, con mayor área de superficie, para conseguir el mismo sabor pero con menor producto. Otro uso es la encapsulación y liberación controlada de ingredientes biactivos (por ejemplo ácidos omega-3), así como el empleo de biosensores y antimicrobianos con fines de calidad y seguridad alimentaria.

Las ventajas que presentan los nanomateriales y nanobiosensores les ha convertido en una herramienta de interés para su utilización en los procesos de la industria del vino con diferentes propósitos, desde la preparación de la materia prima, fermentación del mosto y la fabricación de vino, y el seguimiento de la conservación, incluyendo el control de calidad del producto y del proceso, y pasando por asegurar la seguridad del vino (Monge y Moreno-Arribas, 2016).

El empleo de nanomateriales para la degradación o eliminación de contaminantes en las aguas residuales como resultado de la trituración y el prensado de la uva, y las prácticas de limpieza de las bodegas, incluyen nanopartículas de oro, obtenidas mediante un enfoque electroquímico combinado, e incluso soportadas en el biopolímero quitosano, que han mostrado su utilidad para la degradación de acetaldehído. Como consecuencia del período de trabajo y las tecnologías de vinificación, los volúmenes y las cargas de contaminación varían mucho a lo largo del año. El agua residual puede contener altas concentraciones de compuestos fenólicos, que dificultan el tratamiento a través de procesos biológicos. Un tipo muy conocido de nanomaterial utilizado para la degradación de contaminantes son las nanopartículas de dióxido de titanio (TiO₂). Este tipo de nanoestructura es capaz de fotocatalizar la degradación de contaminantes orgánicos, además ofrece numerosas ventajas, por su bajo coste y es altamente estable, desde un punto de vista químico, y de fácil acceso. Se ha utilizado con éxito para la degradación de distintos tipos de polifenoles, en particular ácido p-cumárico, que puede ser un contaminante de las aguas residuales de vino.

Otra interesante clase de nanomateriales utilizados para el tratamiento de aguas residuales de bodega son los nanocompuestos de arcilla. El uso de arcillas, arcillas orgánicas (minerales arcillosos tratados con organocationes) y nanocompuestos (minerales de arcilla en combinación con polímeros) en el tratamiento del agua y la remediación ambiental se considera un área emergente de la nanotecnología aplicada, y por haber sido ampliamente utilizados para la adsorción de contaminantes orgánicos e inorgánicos. Los minerales de arcilla constituyen una clase de filosilicatos de aluminio hidratados con agua con cationes metálicos en sus estructuras. La estructura cristalina de los minerales de arcilla se compone de láminas bidimensionales de (AlSi)₃O₄, dando lugar a una pila de capas (plaquetas) separadas por capas intermedias.

Los dendrímeros son nanosistemas moleculares también constituyen una interesante clase de nanomateriales aplicados en varios campos, especialmente como agentes de encapsulación. Entre ellos, se han utilizado dendrímeros para la encapsulación y la eliminación de ácido tartárico de vinos. La unión de ácido tartárico en el interior del dendrímero forma un complejo de ácido tartárico-dendrímero, que puede ser separada de que las muestras de vino o se invierte a través de procesos de diálisis de ultrafiltración.

Con el rápido desarrollo de la nanotecnología, las nanopartículas han mostrado aplicaciones potenciales en el campo de la biotecnología, incluyendo los microorganismos del vino, entre los que destaca el desarrollo de nanomateriales relacionados con la inmovilización o vectorización de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Entre los materiales utilizados, la nanocelulosa, y más específicamente la celulosa nanotubular, ha mostrado su utilidad como soporte de las levaduras durante la fermentación alcohólica, disminuyendo la energía de activación y aumentando el rendimiento de la fermentación.

Desde hace años, existe un claro interés en minimizar el contenido de dióxido de azufre (SO₂) en alimentos y bebidas, incluido el vino, debido al aumento de problemas para la salud humana y a una legislación cada vez más estricta sobre los conservantes alimentarios (Du Toit y Pretorius, 2000; Santos et al., 2012). Sin embargo, el uso de SO₂ en la elaboración del vino, se considera indispensable, por sus propiedades enológicas que incluyen una serie de mecanismos antioxidantes (incluyendo la inhibición de enzimas oxidasas y de eliminación de oxígeno), la actividad antimicrobiana y la participación en la estabilización del color (Guerrero y Cantos-Villar, 2015). Por ende, hay un claro interés en la búsqueda de alternativas capaces de sustituir o complementar la acción del SO₂ para reducir su nivel en el producto final lo que ha marcado una línea de investigación que hasta el momento ha permitido el estudio, y en algunos casos el lanzamiento al mercado, de diferentes tratamientos alternativos (García-Ruiz et al., 2008; Gil-Sánchez et al., 2016). Entre los tratamientos físicos cabe destacar las altas presiones, ultrasonidos de alta presión y campos eléctricos pulsados, y entre los químicos, dicarbonato de dimetilo (DMDC), polifenoles y el uso de lisozima. Finalmente, cabe destacar a la plata y sus derivados como una alternativa altamente plausible debido a su gran poder antimicrobiano.

Los potenciales beneficios de la nanotecnología como agentes antimicrobianos en vinificación, desde la materia prima hasta el producto final, así como en todo el conjunto del proceso de elaboración del vino, han convertido este tema en una línea de investigación a potenciar, con un interés manifiesto tanto por parte de los Organismos competentes, como la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) y la Unión Europea, como de las bodegas. Sin embargo, hasta el momento los estudios sobre el empleo de la plata como antimicrobiano en la elaboración del vino son escasos y se dispone de pocos datos sobre el efecto de estos productos en el crecimiento de los distintos microorganismos del vino, y su modo de acción. No obstante, cabe destacar que hay equipos de investigación españoles que llevan ya algún tiempo trabajando en productos de plata, en particular, en un complejo caolín-plata cuyo potencial antimicrobiano se ha evaluado en diferentes experimentos de vinificación (Izquierdo-Cañas et al., 2012; Garde-Cerdán et al., 2014).

Recientemente, nuestro grupo de investigación ha evaluado la capacidad de nanopartículas de plata biocompatibles para controlar el crecimiento de las principales especies de bacterias lácticas y acéticas del vino en medios de cultivo, incluyendo el estudio del mecanismo de inhibición celular (García-Ruiz et al., 2015a, b). Uno de los objetivos en la obtención de estos nanomateriales era poder emplearlos como agentes bactericidas anclados a la superficie de un sustrato para evitar su dispersión en el medio. Por ello, se realizó la producción de nanomateriales basados en nanopartículas de plata y estabilizados por agentes químicos (polímeros o moléculas) que fueran biocompatibles con el vino. Así, se eligieron el polímero polietilenglicol (PEG-Ag) y la molécula glutatión (GSH-Ag) como agentes estabilizantes de las nanopartículas.

En una primera fase, se realizaron ensayos de actividad antimicrobiana de las nanopartículas de plata sobre bacterias lácticas y acéticas procedentes de vinos, incluyendo en total 11 cepas de bacterias lácticas de distintas especies presentes en el vino (Pentococcus pentosaceus CIAL-16, P. pentosaceus CIAL-49, Lactobacillus casei CIAL-51, L. casei CIAL-52, P. pentosaceus CIAL-85, P. pentosaceus CIAL-86, L. casei CIAL-92, L. plantarum CIAL-121, Oenococcus oeni CIAL-117, O. oeni CIAL-118 y O. oeni CIAL-119), y 2 cepas de bacterias acéticas (Acetobacter aceti CECT-298 y Gluconobacter oxydans CECT-360). La actividad antimicrobiana de los materiales frente a las distintas bacterias se ha evaluado como: a) inhibición del crecimiento bacteriano a través del parámetro IC50 (concentración que inhibe el crecimiento bacteriano al 50%), y b) inactivación bacteriana a través del parámetro de supervivencia MBC (concentración mínima bactericida; concentración más baja que es capaz de inactivar al 99,9% de los microorganismos presentes en el inóculo inicial). En el caso del parámetro IC₅₀, también se ha considerado dos tiempos de medida o fases del crecimiento bacteriano: a) fase exponencial y b) fase estacionaria. Los estudios se han realizado en medios de cultivo específicos adicionados de etanol al 6%, con el objetivo de simular condiciones próximas a las del vino. Además se ha evaluado la actividad antimicrobiana del metabisulfito potásico (SO₂) frente a las mismas bacterias, para poder establecer una comparativa de la eficacia de los materiales de plata como alternativa al empleo de este agente antimicrobiano en enología. Entre los resultados obtenidos, se ha confirmado el efecto de nanopartículas con recubrimientos a base de polímeros solubles (polietilenglicol) y una concentración de plata del 20%, y de nanopartículas estabilizadas con glutatión para inhibir el crecimiento de las principales bacterias lácticas y acéticas del vino (García-Ruiz et al., 2015a) (Tabla 1).

Tabla 1. Actividad antimicrobiana (IC₅₀) de los nanomaterials de plata y metabisulfito potásico frente a distintas cepas de bacterias lácticas y acéticas del vino. PEG-Ag NPs: nanopartículas de plata estabilizadas con polietilenglicol, GLU-Ag NPs: nanopartículas de plata estabilizadas con glutatión.

Mediante el empleo de microscopia de epifluorescencia, se ha confirmado la capacidad de los materiales de plata (PEG-Ag NPs y GLU-Ag NPs) de inhibir el crecimiento y la viabilidad celular de cepas de bacterias lácticas y acéticas del vino, y se ha corroborado la mayor sensibilidad de las bacterias acéticas a la exposición de materiales de plata que de las bacterias lácticas, lo que puede explicarse por las diferencias en la estructura de la pared celular (Figura 1). En general, estos resultados muestran la efectividad de los nanomateriales de plata específicamente obtenidos para este estudio, para inhibir el crecimiento de las principales especies de bacterias lácticas y acéticas del vino (García-Ruiz et al., 2015a).

Posteriormente, se evaluó la capacidad de los nanomateriales para el control microbiológico de un vino tinto que se contaminó con una cepa de Brettanomyces bruxellensis. El tratamiento con la nanopartícula PEG-Ag resultó efectivo tras 15 días de contacto con los vinos, disminuyendo la población inicial de Brettanomyces del vino en torno a dos unidades logarítmicas (de 5.10⁴ a 1,2.10² UFC/mL). En lo que se refiere a la nanopartícula con recubrimiento de glutatión (GLU-Ag), también se comprobó su eficacia para disminuir el crecimiento de Brettanomyces en el vino contaminado a los 15 días de tratamiento, aunque con una disminución de la población ligeramente inferior a la observada para PEG-Ag, con valores de UFC/mL de 6·10⁴ en el vino inicial que se redujeron hasta 3,5·10² en el vino tratado con GSH-Ag (Gil-Sánchez et al., manuscrito en preparación).

Finalmente, se llevaron a cabo en ensayos de aptitud antimicrobiana de las nanopartículas en estudio en un vino blanco elaborado industrialmente. Tras finalizar la fermentación alcohólica, el vino se recibió en el laboratorio y se sometió a los distintos tratamientos, para lo que se añadieron las nanopartículas PEG-Ag y GSH-Ag, así como metabisulfito potásico, para obtener un vino control. Para seleccionar la dosis de las dos nanopartículas empleadas en este ensayo (0,5 mg/L de PEG-Ag 20 y 1 mL/L para GSH-Ag), se tuvieron en cuenta los valores IC₅₀ frente a la cepa L. plantarum CIAL-121. Se realizó un seguimiento de la población de bacterias lácticas y acéticas en los vinos tratados, a lo largo del tiempo (0, 24 y 72 horas, 7, 14 y 30 días), y como resultados más relevantes cabe destacar que la nanopartícula PEG-Ag 20 logró una reducción casi completa del crecimiento de bacterias lácticas y acéticas a las 24h de contacto con el vino, y ambas NNP exhibieron una inhibición completa de ambos grupos bacterianos, tras siete días de tratamiento con el vino, incluso en el tratamiento combinado con la mitad de la dosis habitual de SO₂.

Los resultados obtenidos hasta el momento han confirmado el potencial de estas nanopartículas para controlar los procesos microbiológicos que se producen durante la elaboración y conservación del vino. No obstante, se requieren nuevos ensayos experimentales a mayor escala y en distintos tipos de vino. Teniendo en cuenta que todavía existe una barrera normativa en relación a la definición de los productos de la nanotecnología, y especialmente en el etiquetado, otro de los desafíos en la actualidad pasa por estudios que garanticen la inocuidad y seguridad alimentaria de estos nanomateriales.

Estos estudios se han llevado a cabo gracias a la financiación del Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos PRI-PIBAR2011-1358, AGL2012-40172-C02-01 y D.G.I. (MEC)/FEDER CTQ2013-48635-C2-2-P). I. G.-S. agradece la concesión de un contrato FPU.

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