Estrategias para el control de mohos toxigénicos en derivados cárnicos curado-maduros utilizando microorganismos y factores ambientales

Entre los mohos que habitualmente se encuentran en estos productos se han detectado cepas pertenecientes a los géneros Penicillium y Aspergillus, productoras de ocratoxina A (OTA), aflatoxinas (AFs) y ácido ciclopiazónico (ACP) (Alapont y col., 2014; Ferrara y col., 2016; Markov y col., 2013). Estas micotoxinas son compuestos tóxicos que pueden ocasionar efectos nefrotóxicos, inmunotóxicos, hepatotóxicos, genotóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos en la salud del consumidor (IARC 1993). Por ello, es necesario buscar estrategias encaminadas a controlar el crecimiento de mohos indeseables y a reducir la concentración de micotoxinas en los derivados cárnicos curado-madurados.

Uno de los principales problemas asociados a la contaminación fúngica de los derivados cárnicos curado-madurados es la capacidad de algunos mohos para producir una gran variedad de metabolitos secundarios a la vez y la capacidad de difundir hacia el interior del alimento de algunos de estos metabolitos (Peromingo y col., 2019a). Se ha comprobado con diversas técnicas cromatográficas (Malachová y col., 2014; Peromingo y col., 2018a) que cepas pertenecientes a las especies Penicillium griseofulvum y Penicillium nordicum son capaces de producir entre 4 y 9 metabolitos secundarios en salchichón y jamón curado, productos utilizados como modelos de derivados cárnicos curado-madurados (Tablas 1 y 2).

Tabla 1. Concentración de micotoxinas y otros metabolitos secundarios (µg/kg) producidos por Penicillium griseofulvum en la superficie del salchichón y jamón curado (A), entre 1 y 2 cm de profundidad (B) y entre 2 y 3 cm de profundidad (C) después de 15 días de incubación a 20 °C.

¹Incluye la colonia fúngica.

-²Indica niveles por debajo del límite de detección (LOD).

Los principales metabolitos secundarios producidos por P. griseofulvum fueron ACP, roquefortina C, griseofulvina y sus derivados (Tabla 1) mientras que P. nordicum produjo OTA, roquefortina C, questiomicina A, pestalotina y 7-hidroxipestalotina entre otros (Tabla 2). La mayoría de estos metabolitos difunden hasta 3 cm de profundidad en el producto cárnico (Peromingo y col., 2019a), aunque algunos no difundieron más de 2 cm (Tablas 1 y 2). Esta capacidad de difusión que tienen algunas micotoxinas y otros metabolitos secundarios en los alimentos puede estar relacionada con su estructura química, la textura de los alimentos, la solubilidad de las micotoxinas y los metabolitos en los alimentos. (Escobar y col., 2013).

Tabla 2. Concentración de micotoxinas y otros metabolitos secundarios (µg/kg) producidos por Penicillim nordicum en la superficie del salchichón y jamón curado (A), entre 1 y 2 cm de profundidad (B) y entre 2 y 3 cm de profundidad (C) después de 15 días de incubación a 20 °C.

¹Incluye la colonia fúngica.

^-2Indica niveles por debajo del límite de detección (LOD).

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la eliminación de la parte externa del producto cárnico donde han crecido los mohos no es suficiente para controlar el peligro que conlleva la presencia de estas micotoxinas. Este hecho demuestra la gravedad del problema de seguridad alimentaria relacionado con la presencia de micotoxinas en los derivados cárnicos curado-madurados y la necesidad de buscar estrategias basadas en el control de los parámetros ambientales o de microorganismos con actividad antifúngica para reducir el problema asociado a las micotoxinas en estos productos cárnicos.

Los derivados cárnicos curado-madurados son productos sometidos a procesos de maduración de moderada a larga duración en los que la temperatura aumenta progresivamente desde los 7-8 °C hasta los 25-30 °C a la vez que la actividad de agua (a_w) del producto va disminuyendo desde 0,96-0,97 hasta 0,87-0,81 (Toldrá y Aristoy, 2010) con el fin de conseguir productos de gran calidad organoléptica. Por otro lado, los mohos toxigénicos son capaces de crecer y producir micotoxinas en un amplio rango de temperaturas y a_w (Peromingo y col., 2016; 2019b; Rodríguez y col., 2015b), que coinciden con el rango de estos parámetros alcanzados durante el proceso de maduración. Por ello, una posible estrategia para prevenir la presencia de micotoxinas en el producto final es conocer cómo influyen los parámetros ambientales (temperatura y a_w) que se alcanzan durante la etapa de maduración en el procesado de los derivados cárnicos curado-madurados, en el crecimiento, producción de micotoxinas y expresión de los genes relacionados con su biosíntesis.

Para seleccionar las condiciones óptimas y marginales de crecimiento y producción de micotoxinas de los principales mohos toxigénicos, es necesario realizar estudios de ecofisiología donde se utilicen un amplio rango de temperaturas (25, 20, 15 y 10 °C) combinadas con diferentes a_w (0,95, 0,90 y 0,85) y medios de cultivo que simulen la composición de los productos cárnicos elaborados a partir de carne y jamón curado liofilizados (Peromingo y col., 2016; 2019b). Con esta metodología, se ha determinado que las condiciones óptimas y marginales de crecimiento de P. griseofulvum y de producción de ACP se encuentran en valores de a_w entre 0,95-0,90 y temperatura de 25-15 °C (Peromingo y col., 2019b), mientras que las de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus y de producción de AFB1 y AFG1 están entre 0,95-0,85 en el caso de la a_w y 25-15 °C (Peromingo y col., 2016). Para P. nordicum y su capacidad de producir OTA, sus valores óptimos son a_w entre 0,90-0,95 y valores de temperatura entre 10-25 °C (Rodríguez y col., 2015b) (Figura 1).

Figura 1. Efecto de la actividad del agua (a_w) y la temperatura en la producción de aflatoxina B1 y G1 por Aspergillus parasiticus y ASPERGILLUS FLAVUS en medios de cultivo elaborados con carne (A) y jamón curado (B) a 10, 15, 20 y 25 C y a_w de 0,95, 0,90 y 0,85. Los asteriscos indican que no hubo producción de aflatoxinas durante todo el periodo de incubación. Las diferencias significativas entre los valores de a_w a diferentes temperaturas se indican con letras (P=0,05) y las diferencias significativas entre los valores de la temperatura a una a_w diferente se indican mediante números (p=0,05).

Además, se ha comprobado que existe una relación directa entre la expresión de los genes dmaT, pks-nrps y mfs-1 implicados en la ruta biosintética del ACP producido por P. griseofulvum, de los genes reguladores aflR y aflS implicados en la ruta biosintética de las AFs producidas por A. flavus y A. parasiticus (Peromingo y col., 2017; 2019b) y de los genes otapks y otanps, genes clave de la ruta biosíntetica de OTA (Rodríguez y col., 2014), con la producción de estas micotoxinas en las diferentes condiciones de temperatura y a_w.

En consecuencia, desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, conocer las condiciones óptimas y marginales para el crecimiento y la producción de OTA, ACP y AFs puede contribuir a la selección de la estrategia óptima para controlar la contaminación de estos productos con micotoxinas. Además, el análisis temporal de la expresión de los genes biosintéticos podría ayudar a hacer predicciones y, si es necesario, tomar medidas preventivas o correctivas en la industria cárnica para minimizar o controlar la acumulación de estos metabolitos tóxicos en los derivados cárnicos curado-madurados.

El control biológico utilizando microorganismos autóctonos es una alternativa cada vez más utilizada para monitorizar de manera eficiente el crecimiento de mohos toxigénicos y la producción de micotoxinas en los derivados cárnicos curado-madurados. La elección de los microrganismos es esencial, ya que no pueden ser tóxicos y deben mostrar una actividad metabólica adecuada, que no implique la producción de compuestos indeseables. Además, estos microorganismos deben ser capaces de adaptarse a una amplia gama de temperaturas y a_w relacionadas con las condiciones del proceso de elaboración de los productos cárnicos.

En este sentido, las levaduras pueden ser unas buenas candidatas ya que crecen de forma habitual en la superficie de los derivados cárnicos curado-madurados, siendo Debaryomyces hansenii la especie que se encuentra mayoritariamente en estos productos (Andrade y col., 2009). Esta levadura ha mostrado su capacidad antagonista frente a mohos productores de OTA (Andrade y col., 2014; Peromingo y col., 2018b) y frente a mohos productores de AFs (Peromingo y col., 2019c) en derivados cárnicos curado-madurados (Figura 2). Sin embargo, su capacidad inhibitoria parece estar relacionada con la a_w del producto ya que se ha comprobado que dicha cepa es capaz de inhibir significativamente la concentración de OTA y AFs a una a_w de 0,92 mientras que a una a_w de 0,99 y 0,97 no muestra esa capacidad antagonista frente a mohos toxigénicos (Peromingo y col., 2018b; 2019c). Entre los mecanismos de acción que se han sugerido destacan algunos como la competencia por nutrientes y espacio (Andrade y col., 2014), la formación de compuestos volátiles (Núñez y col., 2015), o la adsorción, degradación o bloqueo de la ruta biosintética de micotoxinas (Peromingo y col., 2018b; 2019c).

Por otro lado, existe la posibilidad de utilizar como cultivos protectores mohos no toxigénicos capaces de inhibir el desarrollo de mohos productores de micotoxinas. La cepa P. chrysogenum CECT 20922, aislada de jamón curado, ha mostrado una fuerte actividad antifúngica atribuida a la proteína antifúngica PgAFP frente a una amplia variedad de mohos productores de micotoxinas (Acosta y col., 2009, Delgado y col., 2015) y, además su eficacia como agente de biocontrol ha sido comprobada frente a mohos productores de OTA y AFs en derivados cárnicos curado-madurados (Bernáldez y col., 2014; Rodríguez y col., 2015a).

Para incrementar el efecto bioprotector de estos microorganismos, actualmente se está trabajando en la utilización conjunta de ambos agentes de biocontrol frente a mohos toxigénicos tanto en salchichón como en jamón curado. De hecho, su eficacia ya ha sido verificada frente a mohos productores de ACP en jamón curado obteniendo un 79% de reducción de la concentración de dicha micotoxina (Peromingo y col., 2018c).

El importante riesgo de contaminación de los derivados cárnicos curado-madurados con micotoxinas debido al desarrollo de los mohos toxigénicos en la superficie de los mismos durante el proceso de maduración, justifica la búsqueda de estrategias para controlar el crecimiento de mohos indeseables en estos productos. El control de los factores ambientales, así como la utilización de microorganismos autóctonos como agentes de biocontrol pueden utilizarse como estrategias que limiten el desarrollo de los mohos toxigénicos y, sobre todo, la producción de micotoxinas.

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, el Gobierno de Extremadura y FEDER (AGL2013-45729-P, AGL2016-80209-P, GR15108). B. Peromingo ha sido beneficiaria de una beca predoctoral (BES-2014-069484) otorgada por el Ministerio de Economía y Competitividad.

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