Biomarcadores de calidad y seguridad microbiológica en la industria de vegetales frescos

Si nos centramos en el caso de las hortalizas de hoja mínimamente procesadas o en IV gama, la falta de calidad en estos prodcutos se debe principalmente: 1) al pardeamiento enzimático, 2) al desarrollo de malos olores, 3) al ablandamiento de los tejidos, así como el riesgo microbiológico se debe a 4) la contaminación por patógenos y 5) los cambios en la microbiota que puedan favorecer la supervivencia de patógenos bacterianos. Las investigaciones llevadas a cabo por el Grupo de Investigación en Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales del CEBAS-CSIC se centran en el estudio de distintos biomarcadores que permitan describir y predecir el efecto de factores intrínsecos y/o extrínsecos relacionados con la calidad y seguridad de estos alimentos vegetales. El resultado esperable de la elección de estos biomarcadores de calidad será el poder seleccionar los genotipos más adecuados y conocer la influencia de las condiciones medioambientales, las prácticas agronómicas, las condiciones de manipulación, procesado y conservación para asegurar la calidad de las hortalizas de hoja. El resultado esperable de los biomarcadores de seguridad será el poder establecer estándares microbiológicos para garantizar la seguridad de las hortalizas de hoja y prevenir posibles fuentes de riesgo de contaminación por microorganismos patógenos.

Figura 1. Campo de cultivo utilizado en los estudios de producción primaria por el Grupo de Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales del CEBAS-CSIC en colaboración con la empresa Primaflor SAT.

Los productores y procesadores de hortalizas de hoja mínimamente procesadas o en IV Gama están cada vez más preocupados por mejorar la calidad y garantizar la seguridad de sus productos. Uno de los grandes problemas asociados con las hortalizas de hoja es su corta vida útil, la cual está limitada por la pérdida de frescura debido principalmente al pardeamiento del corte, al desarrollo de malos aromas y a la pérdida de textura. Además, la seguridad alimentaria es difícil de garantizar ya que es uno de los 5 grupos de alimentos de mayor riesgo de contaminación por microorganismos patógenos. Una de las claves del éxito de esta industria es la homogeneidad de las materias primas y las buenas prácticas agrícolas y de fabricación que permitan asegurar la calidad y la seguridad. Por otro lado, en el Grupo de Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales, creemos que los biomarcadores del estado fisiológico, bioquímico y microbiológico que puedan ser medidos y evaluados objetivamente, podrían ser unos indicadores eficaces para predecir la calidad y la seguridad. La identificación de estos biomarcadores ayudaría a prevenir situaciones en precosecha y poscosecha en los que la calidad y la seguridad de estos vegetales pudieran estar comprometidas.

El principal problema de calidad en hortalizas de hoja mínimamente procesadas es el pardeamiento, el cual limita su vida útil. El cortado durante el procesado rompe las membranas celulares, permitiendo la interacción entre enzimas y sustratos, iniciándose el proceso de pardeamiento. La enzima limitante de la velocidad de la ruta de los fenilpropanoides, la fenilalanina amonioliasa (PAL), regulada por el daño celular, aumenta su actividad e incrementa la biosíntesis de polifenoles. Las enzimas polifenol oxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) son las principales responsables del pardeamiento por oxidación de los polifenoles biosintetizados pues dan lugar a quinonas que posteriormente polimerizan con amino ácidos y proteínas de forma no enzimática dando lugar a la acumulación de melaninas. Estos indicadores bioquímicos han sido previamente estudiados, pero ni la concentración total de compuestos fenólicos ni la actividad de la polifenol oxidasa han sido directamente relacionados con el proceso de pardeamiento.

Por metabolómica se podría estudiar los cambios en los metabolitos relacionados con el pardeamiento enzimático, aunque hasta ahora esta técnica no se ha aplicado al estudio de factores pre y poscosecha. En este sentido, se conoce que se han investigado las diferencias entre variedades de lechuga según el contenido en amino ácidos y azúcares y su relación con el pardeamiento. Algunos de los metabolitos primarios o secundarios pueden ser los responsables de las diferencias entre materias primas, prácticas agrícolas, operaciones de procesado y condiciones de conservación, y podrían ser usados como biomarcadores potenciales de calidad y vida útil. Es por ello esencial conocer en profundidad estos metabolitos y su relación con las reacciones enzimáticas y los procesos de pardeamiento. Asimismo los compuestos gaseosos y volátiles del metabolismo respiratorio y no-respiratorio pueden ser también biomarcadores potenciales en poscosecha ya que el estrés y el deterioro de los tejidos vegetales está relacionado con la producción de determinados compuestos gaseosos y volátiles. En hortalizas de hoja, existe una gran variabilidad en la tasa respiratoria de distintas variedades, siendo las de mayor tasa las de vida útil más corta. Las hortalizas de hoja procesadas son envasadas con plásticos semipermeables para alargar su vida útil debido a que el envasado en atmósfera modificada (modified atmosphere packaging, MAP), con bajo oxígeno (O₂) permite retardar la velocidad de pardeamiento del borde del corte. Sin embargo, si el O₂ es muy bajo se puede inducir la fermentación, con emisión de etanol y de otros volátiles no respiratorios. Los malos aromas son el factor más importante de pérdida de calidad después del pardeamiento.

Para los consumidores, la firmeza es otro de los factores más importantes relacionados con la frescura que afecta a la sensación en boca. La firmeza está determinada por la anatomía del tejido, especialmente el tamaño y la forma de las células, el grosor de la pared celular y de la fuerza y extensión de la adherencia entre células. En hortalizas de hoja, la firmeza también está relacionada con la turgencia, la cual está influenciada por diversos factores como es el estado hídrico de las células. Se ha podido diferenciar la calidad ‘buena’ y ‘mala’ de hojas mediante las propiedades mecánicas de la pared celular (% plasticidad) y el tamaño de la epidermis y se ha asociado una mayor vida útil con una menor plasticidad y un menor tamaño de las células epidérmicas.

Figura 2. Equipos de análisis para la determinación de metabolitos vegetales ubicados en el Grupo de Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales del CEBAS-CSIC.

El principal problema de seguridad microbiológica de hortalizas de hojas es que las bacterias entéricas relacionadas con intoxicaciones alimentarias pueden adherirse rápidamente al tejido durante el cultivo, coexistir con las bacterias epífitas y persistir por largos periodos de tiempo. Mediante microscopía y enumeración microbiológica se ha observado que los patógenos entéricos entran en el tejido vegetal a través de aperturas naturales y tejidos dañados. Tradicionalmente, la prevalencia de patógenos se ha determinado bien mediante el análisis cualitativo de presencia o ausencia, o también por el análisis cuantitativo de microorganismos indicadores, los cuales determinan la posible presencia de microorganismos patógenos que son difíciles de detectar. La detección de microorganismos patógenos humanos en las hortalizas frescas conlleva un elevado coste de tiempo y dinero. Además, la baja prevalencia de patógenos en las hortalizas frescas (<1%) hace que la detección de microorganismos indicadores sea el método más utilizado por organismos oficiales para controlar la contaminación fecal.

En concreto, E. coli ha sido utilizado como un microorganismo index para la detección de contaminación fecal. Así, hemos observado que recuentos elevados de E. coli evidencian una mayor probabilidad de contaminación por patógenos de nichos ecológicos parecidos. Sin embargo, varios estudios han resaltado la dificultad de correlacionar la prevalencia de los microorganismos patógenos con los indicadores de contaminación fecal convencionales. Algunos autores observaron que no había correlación entre microorganismos indicadores (E. coli y coliformes) en el agua de riego y en el producto vegetal, destacado la importancia de la cuantificación de E. coli molecular (viable pero no cultivable, VBNC). Otro aspecto importante es que la prevalencia de los microorganismos patógenos puede estar también determinada por su capacidad para competir con la población bacteriana epífita. La microbiota de la filosfera está formada por una gran variedad de bacterias y hongos filamentosos que incluye microorganismos epífitos, fitopatógenos e incluso patógenos humanos. Sin embargo, poco se sabe sobre cómo la composición microbiana de la filosfera cambia a lo largo del tiempo. El conocer la dinámica de las poblaciones microbianas, y concretamente la relación entre la microbiota epífita y los patógenos humanos durante la manipulación pre y poscosecha nos puede ayudar a esclarecer los mecanismos de supervivencia y patogenicidad de dichos patógenos. Los métodos moleculares basados en el análisis del ARN ribosomal (16S) han revelado la complejidad y diversidad de la microbiota epífita. Recientemente, el uso de técnicas de secuenciación masiva como el Ilumina next-generation, ha facilitado la identificación de poblaciones bacterianas permitiendo conocer los cambios en la microbiota epífita en distintas condiciones. El uso de estas herramientas supondría un gran avance en el conocimiento del impacto de las condiciones medioambientales y prácticas agrícolas en la capacidad de colonización de microorganismos patógenos.

El Grupo de Investigación en Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales del CEBAS-CSIC se encuentra actualmente ejecutando el Proyecto de Investigación del Plan Nacional (AGL2013-48529-R) cuyo principal objetivo consiste en la selección de biomarcadores que permitan predecir el efecto de factores intrínsecos y/o extrínsecos que afectan a los aspectos de calidad y de seguridad microbiológica. La calidad estará directamente relacionada con el pardeamiento, los malos olores y el ablandamiento, y la seguridad microbiológica con la cuantificación de microorganismos indicadores de contaminación fecal por técnicas moleculares teniendo en cuenta los microorganismos viables no cultivables (E. coli molecular, fagos ARN F-específicos) y su correlación con la prevalencia de patógenos transmitidos por alimentos (STEC y Salmonella spp.), y la dinámica de poblaciones bacterianas y su influencia en la supervivencia de patógenos bacterianos.

Metabolitos vegetales responsables del pardeamiento enzimático como biomarcadores de calidad

Con el fin de seleccionar aquellos biomarcadores robustos relacionados con el pardeamiento enzimático, ha sido necesario conocer la variabilidad genética antes de estudiar la influencia de distintos factores externos pre y poscosecha. Se ha puesto a punto el análisis de imagen para la medida del pardeamiento enzimático así como un sistema de preparación, extracción y análisis por Cromatografía HPLC acoplado a un sistema de espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y desorción mediante analizador de trampa de iones (Ultra Performance Liquid Chromatography-mass spectrometry-quadrupole time of flight) para la detección, identificación y cuantificación de metabolitos. Estas investigaciones están siendo dirigidas por Francisco Tomás-Barberán e Isabel Gil los cuales están codirigiendo la tesis del becario FPI, D. Carlos García Hernández-Gil. Hasta ahora se ha estudiado en profundidad dos variedades de cada uno de los tipos de lechuga iceberg y romana con grandes diferencias en el pardeamiento enzimático tras el corte. Tras el análisis por agrupación y por componentes principales se han seleccionado 3 grupos principales de metabolitos pertenecientes a fosfolípidos, ácidos grasos y fenilproponoides. Hemos observado que las diferencias entre variedades con un reducido y alto potencial de pardeamiento enzimático a distintos intervalos tras el corte y durante la conservaciónlos se explican por la presencia y contenido en estos metabolitos.

Compuestos gaseosos y volátiles del metabolismo respiratorio y no-respiratorio como biomarcadores de calidad

Se ha puesto a punto el análisis de compuestos volátiles por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas como herramienta de alta selectividad para detectar aromas y el desarrollo de malos olores en hortalizas de hoja. Mediante el detector olfatométrico hemos podido identificar y caracterizar hasta 42 compuestos volátiles, algunos de ellos relacionados con el deterioro y otros con la fermentación del tejido. Estos biomarcadores de deterioro y/o fermentación los estamos aplicando para ayudarnos a predecir la mayor a menor susceptibilidad al deterioro/fermentación de distintas variedades de lechuga.

Características biomecánicas como biomarcadores de calidad

Hemos evaluado distintas propiedades biomecánicas relacionadas con los cambios en la calidad espinaca baby durante la vida útil. Estos estudios forman parte de la tesis doctoral de Dña Yolanda Garrido que defenderá en breve titulada 'Estrategias de intervención en precosecha y poscosecha para mejorar la calidad y prolongar la vida útil de hojas jóvenes en IV gama'. En estos estudios, hemos podido correlacionar las distintas propiedades biomecánicas con algunos parámetros fisiológicos como la eficiencia fotosintética la cual es una medida no destructiva de respuesta de la hoja al estrés oxidativo. Así, hemos estudiado la influencia del momento de la recolección en la calidad del producto procesado comparando distintas horas del día y distintos períodos de retraso hasta el procesado. La cosecha de primera hora del día presentó un mayor contenido en agua y firmeza y mejor calidad visual a lo largo de toda la conservación del producto procesado. Los resultados mostraron que los brotes de espinaca pueden tolerar un retraso hasta su procesado de al menos 48 horas sin presentar síntomas evidentes de pérdida de calidad. También hemos estudiado el efecto de la aplicación de distintos sistemas de enfriado y del tiempo de demora hasta el procesado en la calidad del producto procesado. Hemos observado que la etapa de pre-enfriamiento tiene una mayor influencia en la mejora de la calidad del producto en la cosecha de primavera que en la de invierno. El pre-enfriamiento por vacío y por ducha con agua fría mejora la viveza del color y la hidratación de las hojas, destacando como sistemas más eficaces comparados con el enfriamiento en cámara convencional y por aire forzado. Sin embargo, el enfriamiento por vacío reduce la calidad visual de las hojas debido a un aumento en la fragilidad. Otro de los estudios que hemos llevado a cabo ha sido la influencia del acondicionamiento a distintas temperaturas y humedades relativas en la calidad del producto procesado. Las hojas expuestas a alta humedad relativa (95% HR) tanto a 4 °C como a 15 °C mostraron mayor alteración y pérdida de calidad que las expuestas a baja HR, sin embargo las hojas expuestas a 4 °C + 72% HR, a pesar de que inicialmente mostraron síntomas de estrés fisiológico (mayor deshidratación, menor viveza de color y nivel más alto de pérdida de electrolitos), recuperaron su hidratación y viveza de color tras el lavado, destacando como el material que condujo a un producto con mejor calidad visual.

Microrganismos indicadores como biomarcadores de seguridad

Para alcanzar este objetivo, en primer lugar se han puesto a punto las técnicas de identificación y cuantificación de microorganismos utilizando técnicas moleculares de PCR. En concreto, se ha optimizado la cuantificación de E. coli spp. utilizando la técnica PCR a tiempo real, y la detección de 6 microorganismos patógenos mediante una PCR multiplex, optimizando la técnica para muestras de material vegetal, agua y suelo. En el caso de la técnica de PCR a tiempo real seleccionada, nos ha permitido cuantificar las células de E. coli cultivables, así como las células viables no cultivables y poder comparar dichos recuentos con la prevalencia de microorganismos patógenos. Con el fin de determinar la correlación entre los recuentos de microorganismos indicadores y la prevalencia de microorganismos patógenos hemos llevado a cabo varios estudios a nivel de producción primaria y de planta de procesado. Los resultados obtenidos forman parte de la tesis doctoral de Dña Irene de Castro-Ibáñez que defenderá en breve titulada 'Evaluación del riesgo microbiano en la producción y el procesado de hortalizas de hoja'. Los resultados en producción primaria muestran que la prevalencia de microorganismos patógenos es relativamente baja con un número muy reducido de muestras positivas para Salmonella spp. y ninguna muestra positiva para E. coli enterohemorrágica productora de toxina shiga (STEC incluyendo el serotipo O157:H7). Sin embargo, cabe destacar que las muestras que resultaron positivas para Salmonella mostraron recuentos de E. coli spp. significativamente más elevados. Por otro lado, el estudio llevado a cabo en la planta de procesado mostró que del total de muestras analizadas (n= 155) para determinar la presencia de microorganismos patógenos, ninguna resultó positiva para L. monocytogenes y STEC. E. coli spp. sólo se detectó en muestras de agua procedentes de la centrífuga, dos de las cuales fueron positivas para Salmonella spp. Los resultados obtenidos en estos estudios apoyan la selección de E. coli como un buen indicador de contaminación fecal. Asimismo, hemos desarrollado un modelo con el fin de predecir el riesgo de la exposición microbiana en la cadena de producción de hortalizas de hoja. Este modelo permite determinar el impacto de factores de riesgo de contaminación como es el agua de riego. También hemos llevado a cabo ensayos con el fin de determinar la susceptibilidad de microorganismos patógenos, así como de E. coli spp. a los higienizantes utilizados durante el lavado de hortalizas de hoja con el fin de poder valorar su posible utilización como microorganismo indicador en el procesado de hortalizas de hoja.

Figura 5. Estudio de la dinámica de población microbiana en hojas jóvenes llevado a cabo por el Grupo de Calidad y Seguridad de Alimentos Vegetales del CEBAS-CSIC en los invernaderos de la Universidad de Murcia.  

Dinámica de la población bacteriana epífita y su relación con los microorganismos patógenos

La superficie del vegetal está colonizada por una gran variedad de microrganismos denominados microbiota epífita, predominantemente aerobia. Esta microbiota está compuesta por bacterias residentes además de otras que se depositan transitoriamente y se caracteriza principalmente por miembros de los géneros phylum α-proteobacterias, γ-proteobacterias, bacteroidetes, β-proteobacterias y firmicutes. Los resultados obtenidos hasta ahora nos indican que la composición de la microbiota epífita depende de factores extrínsecos e intrínsecos como el tipo de material vegetal, su estado de madurez, así como las prácticas agronómicas y las condiciones climatológicas. Los ensayos que se están desarrollando están encaminados a determinar cómo los cambios observados en la población epífita pueden influir a la supervivencia de microorganismos patógenos.

El objetivo principal de estas investigaciones es el estudio de distintos biomarcadores como herramientas para predecir la calidad y seguridad de alimentos vegetales. Los biomarcadores podrán ser utilizados por los agricultores y productores para evaluar la selección de nuevas variedades y la incorporación de nuevas prácticas agrícolas con el objetivo de obtener una producción más sostenible sin poner en riesgo la calidad y la seguridad de las hortalizas de hoja. Dentro de la producción sostenible, se evaluaran distintos biomarcadores en una serie de actividades dirigidas al impacto de déficit de riego y las nuevas tecnologías de cultivo sin suelo para la gestión óptima de los recursos. Asimismo, se estudiarán también los biomarcadores como herramientas para prevenir los efectos asociados al cambio climático. Mediante la investigación que se está desarrollando se pretende avanzar en el conocimiento sobre la seguridad alimentaria con la puesta en práctica de medidas de prevención. Los resultados del proyecto estarán disponibles para todas las partes interesadas de la cadena de suministro de alimentos vegetales en fresco, productores, procesadores, asociaciones de industrias agroalimentarias, comunidad científica y autoridades competentes.

Selección de referencias del grupo

• Castro-Ibáñez, I., Gil, M.I., Tudela, J.A., Ivanek, R., Allende, A., 2015. Assessment of microbial risk factors and impact of meteorological conditions during production of baby spinach in the Southeast of Spain. Food Microbiol. 49, 173–181.
• Castro-Ibáñez, I., Tudela, J.A., Gil, M.I., Allende, A., 2015. Microbial safety considerations of flooding in primary production of leafy greens. Food Res. Int. 68, 62–69.
• Castro-Ibáñez, I., López-Gálvez, F., Gil, M.I., Allende, A., 2016. Identification of sampling points suitable for the detection of microbial contamination in fresh-cut processing lines. Food Control, 59, 841–848.
• Garrido, Y., Tudela, J.A., Gil, M.I., 2015. Comparison of industrial precooling systems for minimally processed baby spinach. Postharvest Biol. Technol., 102, 1-8.
• Garrido, Y., Tudela, J.A., Gil, M.I., 2015. Time of day for harvest and delay to processing affect the quality of minimally processed baby spinach. Postharvest Biol. Technol., 110, 9-17.
• Truchado, P., Gil, M.I., Kostic, T., Allende, A.,2015. Optimization and validation of a PMA qPCR method for Escherichia coli quantification in primary production. Food Control, 62, 150-156.