40 ENOLOGÍA MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO FÁCILMENTE ASIMILABLE (NFA) Existen diversos métodos para determinar el NFA, es decir, la suma del contenido en ion amonio y en aminoácidos primarios de una muestra de mosto o vino. Algunos de estos métodos realizan la determinación conjunta mientras que otros realizan una determinación por separado de cada una de las fracciones en consideración. Si se recuerda la definición del NFA, éste podía representarse como la suma de una contribución de origen orgánico (aminoácidos primarios libre, conocidos como PAN o FAN por sus siglas en inglés) y otra de origen inorgánico (ion amonio). Cada una de estas fracciones cuenta con métodos de determinación específico. Se repasa cada una de las opciones a continuación. Método de Sorensen para la determinación conjunta del NFA En este método, con el fin de bloquear los iones amonio y los grupos amino de los aminoácidos presentes la muestra es inicialmente tratada con una solución de formaldehído (también llamado formol). De esta manera, se dejan libres los contraiones ácidos de las sales de amonio y los respectivos grupos carboxilo de los aminoácidos. El dióxido de azufre, habitualmente presente en las muestras de vinos y mostos, puede alterar el resultado obtenido debido a su función ácida, particularmente si las dosis son muy altas. Esta interferencia puede evitarse realizando una defecación previa de la muestra con solución de cloruro de bario. Si bien esta valoración no tiene en cuenta el contenido de prolina entre los aminoácidos que se determinan, existen diversos compuestos que pueden llegar a interferir en la determinación y, por tanto, suelen obtenerse valores en exceso respecto a los otros métodos de determinación del NFA. Durante años el método Sorensen fue la manera habitual de determinar el NFA en mostos y vinos. Sin embargo, la complejidad de la técnica, que precisa de cierta habilidad manual del operador, sumada a las condiciones especiales necesarias para trabajar con un compuesto tóxico como el formaldehído, han llevado a la práctica desaparición de esta técnica de los laboratorios enológicos. Métodos para la determinación del ion amonio Cabe decir que la OIV cuenta con un método oficial para la determinación del ion amonio (OIV-MA-AS-322-01) ción mediante electrodos de iones selectivos, también demostraron ser poco prácticas. Por otra parte, la determinación enzimática del ion amonio ha probado con creces ser la mejor y más eficiente técnica para la medición del contenido de amonio en muestras de vino y mostos. El principio químico de la técnica enzimática se basa en la determinación selectiva y específica del ion amonio a través de su reacción con el ion 2-oxoglutarato en presencia de la enzima glutamato deshidrogenasa y del cofactor NADPH, como se muestra en la Figura 1. Aprovechando las características de absorbancia del cofactor NADPH, es posible realizar un seguimiento espectrofotométrico de esta reacción a través de la lectura de la absorbancia de la mezcla a 340 nm. La utilización de patrones de concentración conocida para efectuar la calibración siguiendo la ley de Lambert-Beer, el empleo de reactivos líquidos y estables a largo plazo como los suministrados por TDI y la aparición hace ya un tiempo de los analizadores químicos automáticos, de los cuales la gama Miura es su mayor exponente, facilitan al operador todas las tareas de manejo de Figura 1. Esquema de la reacción de determinación enzimática del ion amonio. En consecuencia, el pH de la muestra disminuye y la acidez resultante puede ser determinadamediante valoración con solución de hidróxido de sodio 0,1M. Es importante tener en cuenta que, tanto la muestra como la solución de formaldehído, tienen que estar previamente ajustadas a un pH igual a 8 para poder llevar a cabo una determinación precisa y sin interferencias. basado en la fijación del analito de interés a través del uso de una resina de intercambio iónico para su posterior elución, destilación y valoración final con una solución de ácido clorhídrico. Sin embargo, en la práctica es un método demasiado complicado y laborioso para ser utilizado de rutina. Es por esto que con el transcurso del tiempo surgieron varias alternativas. Algunas de ellas, como la determinareactivos, calibración y cálculo de las concentraciones a determinar en las muestras incógnitas. Métodos para la determinación de los aminoácidos primarios Existen variosmétodos químicos utilizados en la derivatización de aminoácidos para su determinación conjunta por espectrofotometría UV-Vis o para su determinación individual a través de
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