nº 27- pág 58 tierras OVINO] 2019 espermatozoides de animales con genotipos que muy valiosos. El problema es que los daños que suceden en la conservación refrigerada son ser aún mayores con la congelación. Los protocolos de congelación son muy variables, pero, en general, consiste en varios pasos de dilución y atemperamiento que concluyen con la congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido. Tras la recogida seminal, se suele hacer una primera dilución en caliente y después se refrigera poco a poco hasta los 5 °C. Entonces, la muestra se ajusta a la concentración final, se empaqueta las dosis (generalmente, en pajuelas), se dejan en frío unas pocas horas para que los espermatozoides se aclimaten e interactúen con el diluyente y se congelan y se almacenan en nitrógeno líquido (-196 °C). Las dosis criopreservadas se pueden mantener en nitrógeno líquido teóricamente durante siglos, ya que lo único que parece afectarles es la radiación ambiental. De hecho, unos investigadores de la Universidad de Sidney (Australia) inseminaron recientemente ovejas con semen que llevaba congelado 50 años. Encontraron que la fertilidad de esas dosis era la misma que la de las dosis que llevaban congeladas solo un año. La gran limitación de la criopreservación seminal en ovino es que, debido al estrés sufrido por los espermatozoides, la fertilidad varía bastante si se utiliza la IA cervical, por lo que se prefiere la inseminación laparoscópica para obtener resultados consistentes. La Figura 4 muestra los resultados de varios trabajos de investigación tras IA vaginal/cervical con semen fresco, refrigerado y criopreservado. Tanto el semen fresco como el refrigerado a 15 °C muestran fertilidades altas. El semen a 5 grados y 24 horas muestra resultados variables, mientras que, en el caso de semen congelado, la fertilidad disminuye considerablemente, corrigiéndose cuando se utiliza inseminación laparoscópica. Hay que resaltar que dl componente racial influye bastante en los resultados del semen congelado. Por ejemplo, en razas de Escandinavia los resultados de fertilidad tras AI cervical con semen criopreservado son muy buenos, principalmente debido a la estructura del cérvix y a sus periodos de anestro. La pérdida de fertilidad del semen congelado se debe a los daños sufridos por las células durante el proceso de criopreservación. El proceso de enfriamiento puede causar choque frío, tal como ocurre en el semen refrigerado, pero en esta ocasión está el problema añadido del hielo que se forma alrededor del espermatozoide durante la congelación. Cuando las células se congelan, en su interior no se suele formar hielo, por lo que el exterior se congela antes. Esto causa una deshidratación de la célula por ósmosis (al congelarse el agua exterior, aumenta la concentración de sales). Esto causa un problema doble, ya que si la congelación es lenta, las células pueden sufrir daños por deshidratación. En cambio, si la congelación es rápida se formarán cristales de hielo en el interior de la célula, al no dar tiempo de que el agua salga, los cuales romperán la célula. Generalmente, se intenta una congelación semi-rápida, en la que se evita la formación de hielo en las células mediante deshidratación, pero la congelación ocurre suficientemente rápido como para evitar daños. Durante la descongelación, los daños ocurren a la inversa, por lo que una descongelación rápida es menos agresiva. Para evitar estas consecuencias negativas del proceso de congelación/descongelación, se añaden crioprotectores a los diluyentes de conservación. Un tipo de crioprotectores están orientados a proteger las membranas celulares, como es el caso de la yema de huevo o la lecitina de soja (este último se considera preferible por bioseguridad, al ser vegetal). Otro tipo de crioprotectores funcionan como estabilizadores de lípidos y proteínas, y que actúan como antinucleadores (evitan la formación de cristales de hielo). Estos estabilizadores pueden ser no permeables (no penetran en la célula), como los azúcares, o permeables (actúan fuera y dentro de la célula). En este último caso, la opción preferida en ovino es el glicerol, presente en casi todos los diluyentes. Algunos diluyentes contienen antioxidantes, que contrarrestan los radicales libres. A pesar del uso de crioprotectores y de la optimización de los protocolos de criopreservación, las células sufren daños en el proceso de congelación/descongelación. Los mismos crioprotectores tienen cierta toxicidad para los espermatozoides, y el movimiento del agua que entra y sale de la célula, así como los cambios de tamaño, provoca estrés en las membranas. También se produce muerte celular por la formación de hielo. Además, aunque las células sobrevivan pueden sufrir criocapacitación, muy importante en ovino. Este proceso se denomina así porque los espermatozoides sufren alteraciones que recuerdan a la capacitación (pérdida de proteínas del plasma seminal, componentes de las membranas, etc.). Este estado es indeseable si se produce antes de tiempo, ya que el espermatozoide puede morir o perder la capacidad de fecundar. Una línea de investigación muy prometedora consiste en la utilización de proteínas del plasma seminal antes o después de la congelación para revertir esta situación. Además, se sabe que la concentración espermática en la crioconservación puede afectar a los resultados. Mientras que un alto número de espermatozoides puede ser ventajoso al inseminar, nuestro grupo encontró que por encima de 400 millones por mililitro se producían cambios en las membranas de los espermatozoides que están relacionados con la muerte celular. Determinamos que congelando a 800 millones por mililitro causaba una disminución de un 10% en la fertilidad. Aparte de las condiciones de congelación, sabemos que otros factores afectan al resultado de la criopreservación en ovino, como el macho y la estacionalidad. Estos factores alteran la composición de la membrana, el comportamiento de los espermatozoides y la composición del plasma seminal, por lo tanto determinando la resistencia del espermatozoide a estos procesos de conservación. Por lo tanto, las líneas de investigación no sólo se enfocan a mejorar los medios y protocolos de congelación, sino que también están orientados a la selección de los machos, su nutrición, el bienestar animal o elementos externos como el clima.
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