DOSIER FRUTOS ROJOS cóctel de tres cepas de S. enterica (Montevideo (ATCC BAA-710), Gaminara (ATCC BAA-711) y Enteritidis (CECT 4300)) y frente a Norovirus murino (MNV-1). 3. Experimentación en fresa Las fresas se inocularon con el cóctel de S. enterica o con el stock de Norovirus murino para obtener una concentración de 106 ufc/fresa. Una vez inoculadas, las fresas se mantuvieron en refrigeración hasta el día siguiente. El día del ensayo, las fresas de recubrieron mediante inmersión en un baño de RP-7. A continuación, se dejaron secar durante 45 minutos a 4°C. Las fresas control, no se recubrieron, pero se dejaron el mismo tiempo en refrigeración. Tras el tiempo de secado, las fresas se congelaron por contacto con nitrógeno líquido durante 30 minutos y se conservaron a -20°C durante 8 semanas. Para determinar la concentración de S. enterica en la fresa, las frutas, directamente congeladas, se colocaron individualmente en una bolsa estéril con agua de peptona tamponada (APT; Biokar, Beauvis, Francia) a la que se aplicó fricción durante 90 segundos. A continuación, se realizó una serie de diluciones decimales en peptona salina (PS; 8,5 g/L de NaCl y 1 g/L de peptona) y se sembró en medio XLD agar, selectivo para el recuento de S. enterica (XLD; Biokar, Beauvis, Francia). En el caso de Norovirus, los recuentos se realizaron de forma homóloga utilizando TGBE (12,1 g/L de Tris base, 3,8 g/L de glicina y 10,0 g de extracto de carne) como diluyente. A continuación, se centrifugó el diluyente y se tituló el sobrenadante utilizando células RAW 264,7. 4. Aceptación visual Para avaluar el efecto de la aplicación del recubrimiento RP-7 en el aspecto de fresa congelada se realizó un ensayo en planta piloto utilizando una cámara de congelación criogénica que se enfría inyectando nitrógeno líquido (N2) en su interior (Carburos Metálicos-Air Products Group modelo Batch Freezer CM-85/1090). Para ello, las fresas se lavaron y la mitad de ellas se recubrieron con RP-7. Tras al secado del RP-7, la fruta se criocongeló y se almacenó durante un mes a -20 °C. Pasado ese tiempo, las fresas se descongelaron y se realizó una evaluación del aspecto visual por 50 jueces no entrenados utilizando una escala hedónica de 9 puntos (siendo 1 me disgusta mucho y 9 me gusta mucho). El aspecto de las fresas se comparó con fresas congeladas comerciales que se descongelaron de forma análoga a las congeladas en planta piloto. 5. Tratamiento de datos y análisis estadístico Los resultados microbiológicos se transformaron a logaritmo decimal (log ufc/fresa). Cuando las bacterias no pudieron contarse, pero se detectaron tras el enriquecimiento, los resultados se expresaron como presencia por debajo del límite de detección (1 ufc/mL). Cuando el patógeno no pudo contarse y tras el enriquecimiento tampoco se detectó, los resultados se expresaron como no detección. Todos los resultados se analizaron utilizando el programa estadístico JMP Pro-17 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Los datos obtenidos han sido tratados por un test de análisis de varianza (ANOVA) para calcular las diferencias significativas entre los resultados. Para observar estas diferencias se aplicó el test de Tukey Honest Significant Difference (HSD) por promedios. El criterio de nivel de significación fue de p<0,05. También se utilizó el test de t-student con el nivel de significancia de p<0,05. RESULTADOS 1. Efectividad de la aplicación de RP-7 frente a S. enterica en fresa congelada La concentración de S. enterica inoculada en fresa sin recubrimiento fue de 5,9 ± 0,4 log ufc/fresa (Figura 1). A tiempo 0 (justo después de la congelación), la población de S. enterica en las fresas con RP-7 fue 2 unidades logarítmicas inferior al control. A lo largo de la conservación en congelación la población de la bacteria se mantuvo constante en las fresas sin recubrimiento, mientras que en las fresas con RP-7 la población de Figura 1. Población de S. enterica inoculada artificialmente en fresas sin recubrimiento (Control) y con recubrimiento (RP-7) conservada a -20°C. Las letras indican las diferencias significativas entre tiempos para cada tratamiento según la prueba HSD de Tukey (p < 0,05). Los asteriscos (*) muestran diferencias significativas entre los dos tratamientos a un tiempo dado según la prueba de t-student (p < 0,05). 46
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