SANIDAD VEGETAL 53 de conidios que finalmente se ajustó a 1x108 conidios/ml mediante la adición de una solución estéril de agua destilada con 0,1% Tween 80. El empapado del suelo se llevó a cabo cuando las plantas de melón alcanzaron la etapa de cuatro hojas verdaderas, 5 ml de la suspensión se vertieron con una pipeta sobre la superficie de la maceta. Las plantas control fueron tratadas de manera similar con una solución estéril de 0,1% Tween 80. Luego, a 50 dpi, se realizó un análisis elemental en materia seca y sustrato. Para ello, el sustrato y el material vegetal, incluidas las partes aéreas y las raíces, se secaron en un horno a 60 °C durante 96 h y se pesaron. El contenido de Fe en materia seca y sustrato se evaluó utilizando la técnica modificada de “Fósforo Olsen” (Olsen et al., 1954). El contenido de Fe se determinó con un espectrofotómetro de absorción atómica (Perkin-Elmer Analyst 200). Actividad de la reductasa férrica y expresión génica de adquisición de Fe Condiciones de crecimiento y material vegetal. Para estudiar la actividad de la reductasa férrica y la expresión relativa de los genes de adquisición de Fe se utilizaron dos especies de cucurbitáceas ( C. melo L. var. Futuro y Cucumis sativus L. var Ashley, Semillas Fitó, S.A., Barcelona, España). Las plantas se mantuvieron en un sistema hidropónico, en condiciones controladas en una cámara de crecimiento a temperaturas diurnas de 22 °C / 20 °C nocturnas, con humedad relativa entre 50 y 70%, y un fotoperíodo de 14 h a una irradiancia fotosintética de 300 μmol m−2 s−1 proporcionado por luz fluorescente blanca (10,000 lux) (Lucena et al., 2006). Para el mantenimiento del sistema hidropónico se utilizó la solución nutritiva Romheld & Marschner (R&M) (Römheld & Marschner, 1981). Después de 10 días (en el caso del pepino) y 13 días (en el caso del melón) de crecimiento, las plantas se separaron en cuatro grupos que posteriormente constituyeron los 4 tratamientos, como se describe a continuación. Preparación del inóculo e inoculación por inmersión. La cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum fue elegida para esta parte del estudio debido a las propiedades previamente demostradas para solubilizar Fe. El inóculo se preparó como se describió anteriormente y se ajustó a 1x107 conidios/ml mediante la adición de solución estéril de agua destilada con 0.1% Tween 80. Las plantas con dos hojas verdaderas fueron seleccionadas y colocadas en bandejas con 2,5 l de solución de inóculo. Las plantas control (no inoculadas) se colocaron en bandejas con 2,5 l de Tween 80% al 0.1%. Todas las plantas se mantuvieron en agitación continua durante 30 min. Después de eso, las plantas inoculadas y no inoculadas se transfirieron a dos condiciones nutricionales diferentes, Fe suficiente (+ Fe40μM) y deficiente (-Fe) para que finalmente se usaran cuatro tratamientos con 42 plantas: Control + Fe40μM (no inoculado), Inoculado + Fe40μM, Control - Fe (no inoculado), Inoculado - Fe. Cada ensayo con ambas especies se repitió dos veces. Determinación de la actividad de la reductasa férrica (FRA). La FRA se determinó tal y como se describe en García et al., (2022) por el método colorimétrico de la Ferrozina. Tras medir la absorbancia a 562nm, las raíces se cortaron y pesaron. Los resultados se expresaron en relación con el peso fresco de raíz. Además, se tomaron los valores de SPAD diariamente (como un proxy de la concentración de clorofila en la hoja) (SPAD 502 Minolta Camera Co., Osaka, Japón). Aislamiento deARN, síntesis deADNc y análisis de qRT-PCR. El análisis de PCR en tiempo real se llevó a cabo tal y como describe García et al., (2021). Las raíces y las hojas verdaderas se homogenizaron con nitrógeno líquido en un mortero hasta obtener un polvo fino. Para el aislamiento de ARN se utilizó Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, EUA) y para la síntesis de ADNc se partió de 3μg de ARN total y se usó el kit iScriptTM cDNA Synthesis (Bio-Rad laboratories, Inc, Hercules, CA, EUA) siguiendo la metodología propuesta por García et al., (2011, 2013). El estudio de la expresión génica mediante qRT-PCR se realizó en un termociclador Bio-Rad CFX, utilizando para ello la máster mix SYBR Green de Bio-Rad siguiendo las instrucciones del fabricante [19,58]. Cada reacción se realizó en un volumen final de 25 μL de los que 2 μL eran de ADNc. Se estudió la expresión relativa de los genes FRO1, IRT1 y HA1 (Aparicio et al., 2023) en pepino, mientras que, en melón, se estudiaron los genes FRO1, FRO2, FRO3, FRO4, IRT1 y FIT (Aparicio et al., 2023; Waters et al., 2014). Los niveles de expresión relativa se calcularon a partir de los valores de los ciclos umbral (Ct) y la eficiencia de los primeros por el método Pfaffl (Pfaffl, 2001). Cada análisis de PCR se realizó en tres réplicas biológicas y cada reacción de PCR se repitió dos veces. Análisis de datos. Los datos de producción de sideróforos de hierro, el contenido total y relativo de Fe en materia seca y sustrato y los datos de FRA se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de rango múltiple de Tukey, diferentes letras sobre las barras indican diferencias significativas ( p < 0.05) entre los tratamientos (Statistix 9.0®, Analytical Software, Tallahassee, FL, EUA). Los resultados de las expresiones génicas relativas se analizaron mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de Dunnett, * ( p < 0.05), ** ( p < 0.01 ) o *** ( p < 0.001 ) sobre las barras indican diferencias significativas en relación con el tratamiento de con-
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