PRODUCCIÓN de idoneidad experimental. Sucesivas rondas permitieron seleccionar una serie de péptidos proteotípicos de valor analítico para el método desarrollado: Vaca (4 péptidos); Oveja (3 péptidos); Cabra (2 péptidos). Fabricación de los quesos patrón utilizados como material de referencia Durante el proyecto se fabricaron 3 quesos de mezcla ternaria y 3 quesos puros con la siguiente composición: • 10% Leche de oveja; 10% Leche de cabra; 80% Leche de vaca • 20% Leche de oveja; 20% Leche de cabra; 60% Leche de vaca • 30% Leche de oveja; 30% Leche de cabra; 40% Leche de vaca • 100% Leche de vaca • 100% Leche de cabra • 100% Leche de oveja Dichos quesos fueron elaborados en condiciones controladas utilizando leche de tres especies cuya composición se determinó mediante procedimientos normalizados en un laboratorio acreditado (ISO/IEC 17025). Los quesos elaborados fueron llevados a maduración en 3 periodos: 1, 3 y 6 meses en cámara con condiciones ambientales controladas. Estos quesos se mantienen en las condiciones adecuadas para disponer de un banco de muestras. Por lo tanto, a efectos de este estudio dichos quesos se han considerado materiales de referencia (RM). Método proteómico dirigido en formato PRM para la cuantificación de mezclas El método desarrollado de cuantificación consta de 3 etapas: • Método de extracción y digestión de proteínas del queso. • Cuantificación de los péptidos proteotípicos en formato PRM. • Método de interpretación de datos y obtención de resultado. APLICACIÓN DEL MÉTODO: ANÁLISIS DE QUESOS CON EL MÉTODO DESARROLLADO Los estudios de aplicabilidad del método desarrollado se realizaron tanto con la serie de los 6 quesos patrón con una maduración entre 1 y 6 meses y con 13 quesos comerciales suministrados por varios fabricantes. En este último caso, la maduración de estos quesos osciló entre 1 y 11 meses. VALIDACIÓN DEL MÉTODO El método de proteómica dirigida utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas se ha validado de acuerdo con las recomendaciones de la AOAC (Association of Official Analytical Collaboration). Los resultados demostraron la linealidad (R2 > 0.98) del método para el análisis de quesos de mezcla en un rango entre 0% a 100% para las tres especies estudiadas. Se ha determinado un límite de detección inferior al 1% para cada especie y un límite de cuantificación inferior al 2%. El estudio ha mostrado valores medios de repetibilidad del 8%, valores medios de reproducibilidad del 10% y valores medios de recuperación/exactitud del 99,6%. Estos datos son indicadores de Tabla. Análisis mediante proteómica dirigida de 13 quesos comerciales. Las columnas 2, 3 y 4 indican el porcentaje de la leche de cada una de las especies empleadas para su fabricación en términos de proteína (%). Las columnas 6,7 y 8 recogen los resultados obtenidos tras el análisis. MUESTRA QUESO COMPOSICIÓN PROTEÍNA RESULTADO LC-MS/MS % vaca % oveja % cabra % vaca % oveja % cabra 1 69 11 20 76 10 14 2 83 9 8 83 10 6 3 58 42 0 57 43 0 4 82 11 7 86 9 5 5 56 28 16 59 28 13 6 58 28 13 69 23 8 7 57 27 16 61 28 11 8 58 28 15 65 23 12 9 56 28 16 65 23 12 10 57 28 15 64 25 11 11 56 29 15 66 24 10 12 0 59 41 0 61 39 13 0 70 30 0 73 27 36
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