AL65 - Tecnología y productos para la industria alimentaria

41 SEGURIDAD ALIMENTARIA Salmonella spp. se basa en el cultivo de el microorganismo en un medio selectivo y consta de 5 pasos básicos: 1. Preenriquecimiento, es este paso la muestra es enriquecida en unmedio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable. 2. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que tiene que cumplir dos condiciones, incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros microor- ganismos presentes en la muestra. 3. Selección en medios sólidos, se utilizan medios selectivos, que restrinjan el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas. 4. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la elimi- nación de cultivos sospechosos falsos. 5. Serotipificación, es una técnica inmu- nológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de un microorganismo. Como técnica alternativa a la tradicio- nal, considerada de confirmación, se ha implantado ampliamente la qPCR. Esta técnica es una evolución de la PCR en la cual se suprime el paso de evaluación mediante electrofo- resis en gel. Se combina en un solo paso la amplificación de secuencias específicas de ADN del microorga- nismo tal como se hace en una PCR convencional con la utilización de un fluoróforo con afinidad por el ADN o sondas marcadas con fluorescencia, que permiten cuantificar las copias de ADN realizadas y de esta manera el número de células originales. Una de las ventajas más grandes que tiene esta variación de la PCR es la realización en condiciones libres de contaminación y poco o nada mani- pulación del operario en el caso de ser automatizado el ensayo. Una diferencia importante entre ambas técnicas (cultivo y qPCR), es el tiempo necesario para realizar los análisis. La emisión de resultados por parte de la mayoría de los laboratorios puede lle- gar a realizarse en el segundo caso en plazos de 24h, mientras que el método tradicional requiere de 3 días. Por contra la qPCR tiene el inconve- niente de cuantificar material genético en la muestra originaria sin distinguir a los microorganismos viables de los no viables, por lo que los resultados son concluyentes en caso de ser nega- tivos, pero no en el de obtenerse un resultado positivo. En este caso, para comprobar que se trata de células viables y poder dar un positivo conclu- yente (hasta ese momento presunto positivo) se requiere de una fase de confirmación Esta fase nos retrotrae al método tradicional y por tanto añade 3 días al plazo de emisión de resul- tados y convierte las 24 h en 4 días. En el caso de alimentos perecederos esto puede significar tener que des- cartar o reprocesar innecesariamente los lotes de producción que resultaron positivos en la qPCR y no se confirman, con la consiguiente pérdida económica y la eventualidad de no poder cumplir con los compromisos de suministro pactados con los clientes. DESARROLLO Y ACREDITACIÓN DE UNA TÉCNICA DE VIABLES QPCR PARA SALMONELLA SPP Ahorrar tres días en el análisis com- pleto de este patógeno constituye por tanto una ventaja competitiva para las empresas que tienen identificado este peligro como riesgo significativo y realizan el control de su producción de forma rutinaria, muy especialmente si tienen implantado un sistema de liberación positiva de lotes (análisis del 100% de lotes producidos y no expedición de lotes positivos). Por ello, el desarrollo de un método que permita la confirmación de viables en la propia qPCR, es decir v-qPCR en condiciones que lo hagan competitivo constituye unamejora sustancial frente a las soluciones actuales. Pero ade- más, dada la criticidad de la garantía de calidad de los resultados, resulta imprescindible contar con una téc- nica acreditada a este efecto en las matrices (productos) objeto de análisis. La técnica que hemos desarrollado se fundamenta en el uso de agentes intercalantes del ADN. Estos agen- tes entran en las células muertas con pared celular dañada, se unen al ADN y no permiten su amplificación en el proceso de qPCR. Se amplifica sola- mente el ADN de las células viables. En la actualidad somos el único labo- ratorio con este método acreditado para el análisis de Salmonella spp. en productos cárnicos, desde productos frescos a productos procesados (pollo asado, carne picada, embutidos, cura- dos, mortadela, etc.). n