El tratamiento con microondas de barricas de roble permitió la inactivación casi total de las bacterias presentes y un descenso importante de la población de levaduras

Desinfección de barricas de roble mediante microondas

I. López-Alfaro; L. González-Arenzana; P. Garijo; J. Martínez; R. López; T. Garde-Cerdan; P. Santamaría (ICVV, Instituto de las Ciencias de la Vid y del Vino)A.R. Gutiérrez (Universidad de la Rioja, CSIC)25/10/2012

En este trabajo se presenta una nueva aplicación de la tecnología de microondas. Se ha analizado la capacidad de un nuevo prototipo, basado en altas frecuencias de microondas, para reducir las poblaciones microbianas en barricas de roble. Se trataron duelas de roble americano y francés procedentes de barricas altamente contaminadas. El tratamiento con microondas fue capaz de disminuir de manera significativa las poblaciones de los principales microorganismos asociados al vino, presentes en los ocho primeros milímetros de la superficie del roble. La reducción de los recuentos viables dependió del microorganismo estudiado. Así, las poblaciones se redujeron entre un 36 y un 38% para las levaduras totales, entre un 35 y un 67% para ‘Brettanomyces’ y alrededor de un 91 y un 100% para las bacterias lácticas y acéticas. Hasta la fecha ningún tratamiento es realmente eficaz para la descontaminación de barricas, por lo que esta tecnología podría ser más efectiva que las existentes en la actualidad.

Introducción

El envejecimiento del vino en barricas de roble es una práctica común y tradicional en el proceso de vinificación que permite obtener vinos de alta calidad. Durante el envejecimiento en barricas el vino se clarifica espontáneamente y adquiere complejidad aromática (Garde-Cerdán, Ancin, 2006). La composición polifenólica se modifica considerablemente y el color se estabiliza debido a reacciones entre antocianos y taninos y a otras reacciones que incluyen el etanal (Martínez, 2006). Estos cambios hacen que los vinos envejecidos en barricas sean preferidos por los consumidores.

Sin embargo, esta técnica es muy cara debido al elevado coste de las barricas, lo que da lugar a que las bodegas las reutilicen durante varios años. Este hecho, junto con la estructura porosa de la madera, favorece la penetración en profundidad de microorganismos, por lo que aumenta el riesgo de contaminación y dificulta la limpieza e higienización del recipiente.

Los sistemas de limpieza utilizados normalmente en bodega eliminan los depósitos de tartratos y los microorganismos existentes en superficie, pero no son capaces de extraer los que se encuentran en profundidad, por lo que las barricas no se esterilizan (Jiranek et al., 2008). Este hecho explicaría parcialmente el problema actual del desarrollo e incidencia de ‘Dekkera/Brettanomyces’ en la enología mundial. Esta levadura se detecta normalmente en vinos envejecidos en barricas, con elevado pH y bajo contenido en sulfuroso. Es capaz de desarrollarse a partir de un bajo número de células, contamina las barricas y produce compuestos con aromas a cuadra, caballo, etc., especialmente el 4-etilfenol (Fugelsang et al., 1993; Snowdon et al., 2006).

Son muchos los estudios llevados a cabo para la descontaminación de barricas. Así, trabajos realizados con vapor o con tratamientos de O₃ gaseoso han demostrado que podían eliminar células de ‘Dekkera/Brettanomyces’ de la madera de roble, hasta una profundidad de 2 mm (Malfeito-Ferreira et al., 2004; Guzzon et al., 2011). Por lo tanto, los microorganismos que se encuentren en capas más profundas, a las que el vino puede penetrar, quedan intactos. Los tratamientos con rayos ultra violeta parecen ser menos efectivos (Guzzon et al., 2011), mientras que la aplicación de ultrasonidos se encuentra en sus primeras etapas de investigación (Jiranek et al., 2008).

El objeto de este trabajo fue iniciar el estudio de la efectividad de la aplicación de la tecnología de microondas en la limpieza e higienización en profundidad (8 mm) de barricas de roble americano y francés. Se ha estudiado la eliminación de microorganismos tales como levaduras ‘Saccharomyces’ y no-‘Saccharomyces’, levadura ‘Dekkera/Brettanomyces’, bacterias lácticas y acéticas y ‘Oenocoocus oeni’.

Material y métodos

Aplicación del tratamiento con microondas

Se ha utilizado un aparato prototipo ‘Innerbarrel’ (www.jmpingenieros.es) que se basa en la generación de microondas de alta frecuencia. El prototipo empleado permite el tratamiento simultáneo de 6 trozos de duelas de 30 cm de longitud. El tratamiento de la madera se realizó durante 3 min a 3000 W (con frecuencias de emisión de microondas de 0-90% 10 s, 90% 40 s y 90-0% 10 s; repetidas 3 veces). Estas condiciones fueron las más eficientes en tratamientos anteriores (datos no mostrados). La temperatura máxima alcanzada en la superficie de la madera fue de 48 °C.

La duelas tratadas procedieron de dos barricas de 225 l de capacidad, una de roble americano (‘Q. alba’) de 3 años y la otra de roble francés (‘Q. petrea’) de 2 años. Ambas barricas se encontraban altamente contaminadas. Las barricas se lavaron previamente con vapor a presión y posteriormente se desmontaron para separar las duelas y cortarlas en trozos de 30 cm. De cada duela se obtuvieron dos partes, una de ellas se trató con microondas y la otra se dejó sin tratar.

Análisis microbiológicos

De cada trozo de duela (tratado y sin tratar) se lijaron unos 5 cm de la madera hasta una profundidad de 8 mm, con un cepillo eléctrico. A partir de las virutas obtenidas se llevaron a cabo los análisis microbiológicos. Se tomaron 10 g de dichas virutas y se incubaron en 250 ml de un medio con 30 g/l de TSB, 20 g/l de extracto de levadura y 1 ml/l de Tween-80 (Oliveira et al., 1995) durante 24 h a temperatura ambiente, con agitación. El ensayo se llevo a cabo por duplicado.

La solución resultante se centrifugó (30 min, 10,000 xg, 4 °C) se decantó y se recogió la biomasa microbiana por decantación. El pellet final se resuspendió en un volumen final de 5 ml. Esta solución se sembró, con o sin dilución, para la determinación de las poblaciones de levaduras y bacterias en la madera.

El recuento de microorganismos se llevó a cabo sembrando la solución en distintos medios. Levaduras totales: cloranfenicol glucosa agar y DBDM agar para ‘Brettanomyces spp.’ (Rodrigues et al., 2001). Las placas se incubaron a 26 °C durante 3 días en el caso de levaduras totales y al menos durante 3 semanas en el caso de ‘Brettanomyces’. Con el fin de obtener seguridad en el recuento de estos últimos microorganismos, se llevó a cabo su identificación mediante análisis de PCR-RFLP de la región ITS del ADN ribosomal (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Para bacterias lácticas anaerobias y Gram positivas, la muestra se sembró en MRS agar suplementado con zumo de tomate (10% v/v), fructosa (6 g/l), cisteina-HCl (0.5 g/l), ácido DL-málico (5 g/l) y 100 mg de pimaricina/l en condiciones anaerobias a 30 °C, durante 10 días. Para bacterias acéticas el medio empleado fue D-manitol (25 g/l), agar (15 g/l), peptona (3 g/l), extracto de levadura (5 g/l), penicilina (3 U/ml) y pimaricina (100 mg/l) a 26 °C durante 5 días.

Resultados y discusión

La identificación de las colonias de levaduras crecidas en DBDM agar, mediante PCR-RFLP de la región ITS del ADN ribosomal, permitió determinar que el 98% de las colonias procedentes del roble francés y el 99.6% del roble americano pertenecían a la especie ‘Brettanomyces bruxellenxis’. La población microbiana viable, expresada como log ufc/g de madera de la superficie interna de la barrica, detectada en la madera de roble americano y francés se encuentra reflejada en las Tablas 1 y 2 respectivamente.

A pesar de la limpieza previa de las barricas con vapor a presión, las duelas de ambas barricas presentaron una alta contaminación microbiológica. Los niveles obtenidos pueden ser capaces de producir una contaminación posterior en el vino (Loureiro, Malfeito-Ferreira, 2006; Bartowsky, 2009) y muestran la dificultad de higienización de barricas con los medios tradicionales (Fugelsang, Edwards, 2007). Así, se obtuvieron recuentos superiores a 4,16 unidades logarítmicas en levaduras totales, 3,27 unidades logarítmicas para ‘Brettanomyces bruxellenxis’, 2,15 unidades logarítmicas para bacterias lácticas y 2,48 unidades logarítmicas para bacterias acéticas. Estos recuentos estuvieron de acuerdo con estudios previos realizados en la superficie de barricas o en el líquido que contenían (Renouf, et al., 2006; Barata, et al., 2008; Guzzon et al., 2011).

Tabla 1: Recuento de la población de microorganismos en la superficie interna (8 mm) de barricas de roble americano antes y después del tratamiento con microondas (log ufc/ml ± sd; n=2).

Los resultados obtenidos en el recuento de microorganismos viables en las duelas tratadas mostraron la existencia de inactivación microbiológica después del tratamiento con microondas. Así, las poblaciones encontradas fueron inferiores a 3,24 unidades logarítmicas para levaduras totales, 2,74 para ‘Brettanomyces bruxellenxis’, 0,20 para bacterias lácticas y cero para bacterias acéticas (Tabla 1 y 2).

En nuestro caso, los niveles de levaduras disminuyeron desde 1,46 a 2,19 ciclos, mientras que los de bacterias lo hicieron entre un 1,95 a 5,13 ciclos. Por lo tanto, el tratamiento disminuyó alrededor del 36% y el 38% de la población inicial de levaduras, entre el 35% y el 67% de la población de ‘Brettanomyces bruxellenxis’, entre el 91% y el 100% de la población de bacterias lácticas en madera de roble francés y americano respectivamente y el 100% de las acéticas en ambas maderas. Por lo tanto, la inactivación de las bacterias fue muy alta, como se ha descrito en otras aplicaciones de esta técnica. (Barnabas et al., 2010; Zhou et al., 2010; Savi et al.).

Tabla 2: Recuento de la población de microorganismos en la superficie interna (8 mm) de barricas de roble francés antes y después del tratamiento con microondas (log ufc/ml ± sd; n=2).

Conclusiones

El tratamiento con microondas de barricas de roble permitió la inactivación casi total de las bacterias presentes y un descenso importante de la población de levaduras, incluida ‘Brettanomyces bruxellenxis’, importante levadura de contaminación. Esta disminución constituye una mejora de los resultados obtenidos con otras técnicas, lo que puede ser muy beneficioso en la industria enológica.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Gobierno de la Rioja y fondos FEDER de la CEE. Se ha contado con la colaboración de las empresas JMP Ingenieros y Laboratorios Excell Ibérica S.L.

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